CDK16基因敲除HEK293T细胞RIPA裂解液;K333

Western 实验步骤

样本准备 蛋白提取 所需仪器：匀浆器、RIPA 裂解液、PMSF（蛋白酶抑制剂）、磷酸酶抑制剂、剪刀、镊子，消毒酒精棉、PBS、移液器、离心机。 裂解液配制——RIPA 裂解液：PMSF=100：1。 1） 组织处理：首先用酒精棉消毒剪刀和镊子，取适量的组织于匀浆器中，用剪刀剪碎加适量的裂解液冰水中匀浆 1-4 min。匀浆结束后吸取溶液于 EP 管中保存备用。（含血液较多的组织可先用 PBS 清洗后再匀浆） 2） 细胞处理： A、 贴壁细胞处理：去掉培养基用 PBS 清洗后加入适量的裂解液

Western Blot，如何成功优化？

Tubulin55kDa胞浆和全细胞VCDA1/Porin31kDa线粒体COXIV16kDa线粒体Lamin B116kDa细胞核（不适于去除核膜的样本）TBP38kDa胞浆和全细胞转膜PVDF 膜NC 膜尼龙膜灵敏度和分辨率高高高背景低低较高蛋白结合能力100-200μg/cm2 （适用于SDS 存在时与蛋白结合）80-100μg/cm2大于400μg/cm2机械强度强干的膜易脆软而结实溶剂抗性强差差浸润100% 甲醛缓冲液缓冲液适用染色方法胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁胶体金、丽春

跑个漂亮的 Caspase-3 结果图，真的那么难吗？

来破碎。04 我的蛋白上样量足够吗？对于组织提取的蛋白，由于只有一小部分细胞可能会发生凋亡。因此，CST 科学家建议每个孔上样 100 μg。而对于诱导的细胞系提取的蛋白，20～30 μg 就足够了。05 我用的跑胶条件合适么？我们通常强烈建议用 16% 或 4～20% Tris-Glycine 胶检测 cleaved caspase-3（17, 19k Da）。如果是用 Bis-Tris 胶，最好用更适应于小分子量电泳的 MES 跑胶缓冲液，而不是 MOPS 跑胶缓冲液。06 我转膜用的膜孔径大小