cDNA 第一链合成 RT-PCR 逆转录试剂盒 预混型

cDNA第一链的合成

通过体外无细胞系统翻译找出目的基因mRNA以后，变可进行cDNA第一链的合成，其步骤包括： 1）在Ependorf管中加50pmol/L的一种α32PdNTP和1mg/ml的mRNA 10μl（10μg），100m mol/L甲基氢氧化汞1μl，室温反应l0分钟，使RNA变性。 2)加100m mol/L的β-巯基乙醇2μl和10m mol/L RNA酶抑制剂2μl，室温放置5分钟。β-巯基乙醇有稳定逆转录酶活性的作用。 3)向上述反应混合物加lmg／ml

四 逆转录PCR (RT-PCR)

.nih.gov查它的序列，并用oligo等软件设计引物。 RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测或克隆多个基因的mRNA时比较有用。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。而一步法RT-PCR具有其它优点（表4.2），cDNA合成和扩增反应在同一管中进行，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏

教您正确选择逆转录酶，适用 6 种不同应用

（RT-qPCR） 定量 RT-PCR（RT-qPCR）的最常见应用之一是通过对细胞和组织一段时间或事件后（如，药物治疗）实时 mRNA 水平的定量分析。RT-qPCR 比 RT-PCR 的灵敏度更高， RT-qPCR 基因表达定量的准确性在很大程度上取决于 cDNA 模板的质量和数量。因此，逆转录对于 RT-qPCR 的成功至关重要。所选择的逆转录酶应该具有以下特点： 高效合成 cDNA 的能力，即使是对低丰度基因以及次优质和/或难转录 RNA 样本。 在宽的 RNA 起始量范围内，cDNA