细胞线粒体分离试剂盒 Cell Mitochondria I

产品简介

线粒体是细胞的动力工厂，进行氧化磷酸化的场所。细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应，制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。对线粒体进行分离，以此为研究对象，对线粒体呼吸作用、mtDNA、mtRNA以及其他线粒体蛋白性能分析等具有重要意义。

本试剂盒可以快速便捷的分离培养细胞中的线粒体，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素 C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于 SDS-PAGE、Western、双向电泳等蛋白分析。  

使用方法（仅供参考）

1、 清洗：用预冷的 PBS 清洗细胞 1 次，4℃ 1000g 离心 5min，弃上清。

2、 裂解：沉淀用1～2ml预冷的裂解液重悬细胞，冰浴放置 10～15min，可用相差显微镜检测膨胀的程度。

3、 匀浆：把细胞悬液转移至匀浆器中，匀浆 10～20 次。不同细胞或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。

4、 取匀浆液，立即加入等量洗涤液，轻轻颠倒混匀数次。

5、 4℃ 1300g 离心 5min 以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。

6、 上清液转移至一干净离心管，4℃ 1000g 离心 5min，重复 2 次。

7、 上清液转移至一干净离心管，4℃ 12000～15000g 离心 15min，重复 1 次。

8、 弃上清，沉淀为线粒体。如果希望获得去除线粒体的细胞浆蛋白，应在本步骤中收集上清，并且在收集上清时注意勿触及沉淀，随后把收集的上清 12000g 4℃离心 10min，上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。

9、 保存：弃上清，用适当缓冲液悬浮沉淀。如果用于线粒体酶活性或功能的分析，线粒体

沉淀应重悬于线粒体储存缓冲液；如果用于细胞浆蛋白的分析，获得的细胞浆蛋白应保存于 1×蛋白储存缓冲液，即按细胞浆蛋白：蛋白储存缓冲液 (5×)=4：1比例混合；如果用于双向电泳，应使用恰当的保存液。

有效期

-20℃保存一年。

注意事项

1、 细胞计数 (如台盼蓝染色液)对于不同实验不必全部使用，实验条件成熟后可以不用。

2、 如果不是用于制备线粒体蛋白，裂解液和洗涤液中不必加入 PMSF。如果用于制备线粒体蛋白样品，裂解液和洗涤液中需添加 PMSF。PMSF 一定要在试剂加入到样品中前 1～2min 内加入，以免 PMSF在水溶液中失效。

3、 分离线粒体的所有步骤均需在冰上或 4℃进行，所用溶液需冰浴或 4℃预冷，全部操作时间尽量控制在 1h 以内。

4、 通常在分离线粒体时前后两次离心速度选取 1000g 和 15000g，如果希望纯度更高，但对线粒体的得率要求不高，前后两次离心速度可用 2000g 和 6000g。

5、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。