嘌呤霉素溶液 Puromycin

CAS: 58-58-2          Formula: C₂₂H₂₉N₇O₅·2HCl          MW: 544.43

产品简介

Puromycin是来源于Streptomyces alboniger的一种氨基核苷类抗生素,中文名为嘌呤霉素,常用于筛选能够表达pac基因（puror）的细胞。pac基因表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase),如果该基因表达,就会对嘌呤霉素产生抗性,这一特性目前普遍应用于筛选表达pac基因的哺乳动物稳定细胞株。目前,很多商业化的慢病毒载体都携带pac基因(一般在质粒图谱上标记为puror),可以利用嘌呤霉素的筛选,得到特定基因稳定表达的细胞株。嘌呤霉素也可以用来筛选表达pac基因的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。Puromycin不仅能用于稳定细胞株的筛选,也用于稳定细胞株的维持。Puromycin的作用特点是快速作用于细胞,一般2天内可以杀死99%的不表达pac基因的细胞。

本产品浓度为10mg/ml,已过滤除菌,可以直接用于细胞培养。

使用说明

一、推荐工作浓度

推荐的作用于哺乳动物细胞的嘌呤霉素浓度一般为1-10μg/ml,但最佳工作浓度需要通过剂量反应曲线来确定。 

二、嘌呤霉素剂量反应曲线的确定(以shRNA转染或者慢病毒感染为例）

嘌呤霉素的有效筛选浓度与细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢及细胞所处细胞周期等因素相关。为了筛选到稳定表达的shRNA或感染病毒的细胞株,确定杀死未转染/感染细胞的最低浓度嘌呤霉素非常重要。对于初次使用的细胞,一般需要通过实验来确定适合自身实验体系的剂量反应曲线(dose-response curve or kill curve)。

1、第一天：24孔板中以5~8×104cells/孔的密度接种细胞,接种够量的孔以便进行后续的剂量梯度实验。细胞培养箱内培养过夜。

2、第二天： 在培养过夜后的细胞中更换新鲜配制的筛选培养基,该筛选培养基为含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0、1、2.5、5、7.5、10μg/ml等),更换培养基后在细胞培养箱中继续培养。

3、第三天后：由于嘌呤霉素可以快速作用于细胞,一般2天内可以杀死99%的未表达pac基因的细胞,所以在加嘌呤霉素后的1-2天就可以进行观察细胞存活率,从而确定有效杀死正常细胞的药物最低浓度。如果细胞耐药性比较强,需要每日观察,一般4-10天内即可确定嘌呤霉素的最低浓度。

三、哺乳动物稳定表达细胞株的筛选

转染含有pac基因的质粒或者感染含有该基因的病毒后,即可筛选稳定表达株。

1、细胞转染或感染48小时后,将细胞置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养,此为处理组。

注意：当细胞处于分裂活跃期时,抗生素作用最明显。细胞过于密集,抗生素产生的效力会明显下降,所以细胞的密度最好不超过25%。建议同时做一个正常细胞的对照组。转染或感染48小时后,如果细胞过密也可以消化后重新接种细胞,培养过夜后即可进行嘌呤霉素筛选。

2、每隔2-3天,更换含有嘌呤霉素的培养基。

3、筛选7天后,对照组正常细胞应该100%死亡,处理组中存活的细胞为表达pac基因的细胞。然后根据实验目的进行多克隆或单克隆细胞的筛选。

注意：每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要24小时,有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在2-10天。

4、待细胞可以稳定生长后,嘌呤霉素的浓度可以减半用于后续的培养。在得到稳定表达细胞株后,一般建议嘌呤霉素也须持续加入,并2-3天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液。

保存条件

-20℃保存,一年有效,尽量避免反复冻融。

注意事项

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。