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- 2025年08月18日
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怎么看免疫共沉淀里的ip和input
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免疫共沉淀中IP与INPUT结果的解读策略
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）是研究dànbáizhì相互作用的核心技术，其核心数据对比集中在IP（免疫沉淀产物）与INPUT（输入对照）的检测结果上。解读IP和INPUT条带时，需从实验设计、抗体特异性、信号强度比及背景控制四个维度综合分析。INPUT作为全细胞裂解液的直接检测样本，代表目标蛋白在样品中的总表达量，是判断IP富集效率的基准；而IP条带则反映抗体捕获的目标蛋白及其互作复合物的量。若IP信号显著强于INPUT中的对应条带（需通过灰度分析定量），表明存在特异性富集；若两者强度相近或IP更弱，则需怀疑抗体效率低或存在非特异性结合。值得注意的是，INPUT的加载量通常仅为IP样本的1%-10%（根据裂解液稀释比例调整），因此直接比较条带juéduì强度无意义，必须通过标准化处理（如INPUT信号校正或与内参对比）才能得出可靠结论。
在技术层面，IP结果的可靠性首先取决于抗体的质量。一抗需经过严格的验证（如敲除/敲低实验验证），且其结合表位不应被IP洗涤条件破坏。其次，洗涤缓冲液的严格性（如盐离子浓度、去垢剂类型）直接影响背景水平：高背景会掩盖真实信号，而过度洗涤可能导致弱互作丢失。此外，INPUT样本的处理同样关键，需确保裂解充分且避免蛋白降解（建议使用新鲜制备的蛋白酶抑制剂混合物）。若检测磷酸化蛋白等修饰状态，INPUT需添加磷酸酶抑制剂。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定，但核心成本通常集中在抗体采购和质谱验证环节。
对于数据呈现，Western Blot检测IP和INPUT时，建议在同一块胶上同步跑样以减少技术误差，并通过不同曝光时间确保线性检测范围。当研究蛋白复合物时，需在IP产物中检测共沉淀的候选互作蛋白，而INPUT作为阴性对照可排除非特异性结合（例如，若候选蛋白在INPUT中高表达但未出现在IP中，则互作不成立）。多克隆抗体可能引起更高的背景，此时可引入同种属IgG作为阴性对照。对于定量分析，建议使用化学发光成像系统采集数据，并通过ImageJ等软件计算IP/INPUT信号比，比值大于2通常认为具有统计学意义。若需更高通量分析，可结合质谱技术对IP产物进行深度鉴定，但需注意区分特异性结合与污染物。
常见问题：
Q1. 当INPUT中目标蛋白信号微弱而IP条带jíqiáng时，如何判断这是真实富集还是抗体非特异性结合？
A：需通过以下对照实验验证：（1）使用目标蛋白敲除细胞株的裂解液平行实验，若IP条带消失则为真实信号；（2）在野生型样本中加入竞争性抗原肽，若信号被阻断则证明抗体特异性；（3）检测IP产物中是否同时富集已知互作蛋白。
Q2. IP与INPUT样本的蛋白加载量应如何标准化？
A：推荐两种方法：（1）根据裂解液体积比计算，例如IP使用1mg总蛋白对应的裂解液，则INPUT加载量按IP裂解液体积/总裂解液体积的比例稀释；（2）通过管家蛋白（如GAPDH）信号校正，但需确认该蛋白在IP过程中未被共沉淀。
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文献和实验某个实验间隙… 萌新：开题报告已提交，转眼 1 个月过去了，实验还是一头雾水，为啥我的 co-IP 拉不下来蛋白？ 奋斗中的师兄：我当初正好相反，拉下来的蛋白被抗体条带覆盖住了，换个抗体忒不好找，无奈换了个蛋白，还好挺顺利。 大师兄：蛋白吧，不但种类多，理化性质差异较大，关键它们又喜欢组队在细胞里干活，IP、co-IP 又是常用的手段，掌握好这个工具还是很重要的，总不能随随便便就换个蛋白。 那要怎么快速掌握这项实验，轻松搞定各种疑难杂症呢？ 我们依据三十多年的 IP/co-IP 实验经验，总结
，从左往右依次是生物学重复样品 NC- 1～ 样品 NC- 3，每个样品 3 个泳道，分别为：样品（Input），使用目的组蛋白特异性抗体进行 ChIP 富集的产物（IP），使用 IgG 进行 ChIP 富集的产物（IgG）。Input：阳性对照样品（ChIP 实验前取部分样品作为阳性对照），在样品中可以检测到目的组蛋白的表达；IP：用组蛋白特异性的抗体进行免疫沉淀（IP），对沉淀产物进行 WB 检测出现目的条带，说明免疫沉淀获得目的组蛋白；IgG：使用无特异性的 IgG 代替特异性抗体进行免疫
糖凝胶上检测分析。如图一所示 图一：2.2 超声破碎后，8000g，30秒，4°C,离心。将上清移入新的管子中。开始准备进行染色质免疫共沉淀（IP）。2.3 每份超声样品取50ul，这时的样品标记为INPUT，用于定量DNA浓度和作为PCR的空白对照。超声后的染色质应立刻冻入液氮中或者储存于-70°C可储存2个月。避免多次反复冻融。3检测DNA浓度1INPUT样品用于为后来的IP样品计算DNA浓度。DNA可采用PCR纯化试剂盒（加入70ul洗脱液，接着进入3.2a）或者采用酚/氯仿抽提（加入350ul
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