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- 2025年08月05日
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北京百泰派克生物科技有限公司
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融合蛋白的纯化方法
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融合蛋白的纯化方法的技术原理与应用策略
在重组蛋白表达系统中，融合蛋白的纯化方法因其高效性和特异性成为蛋白制备的核心环节。这类技术通过在目标蛋白序列中引入亲和标签（如His-tag、GST或MBP等），利用标签与配体间的特异性相互作用实现快速分离。以zuì常见的镍柱亲和层析为例，zǔānsuān标签可与固定化镍离子形成配位键，在非变性条件下选择性吸附融合蛋白，再通过咪唑竞争性洗脱获得高纯度产物。对于需要保持天然构象的蛋白，该融合蛋白的纯化方法能有效避免强变性剂导致的失活风险。
除金属螯合层析外，基于免疫亲和原理的FLAG-tag系统通过抗原-抗体反应实现单步纯化，但抗体成本较高。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。而尺寸排阻层析作为融合蛋白的纯化方法的补充手段，可依据分子量差异去除聚集体或降解片段，尤其在多亚基复合体制备中具有dútè优势。近年来，温度响应性标签（如ELP）的引入使得仅通过离心即可完成相分离纯化，大幅简化了操作流程。
在融合蛋白的纯化方法优化中，缓冲液pH和离子强度的jīngquè调控至关重要。例如，在钙调素结合肽（CBP）标签纯化时，EDTA的加入会破坏钙离子依赖性结合，实现温和洗脱。此外，蛋白酶切割位点（如TEV蛋白酶识别序列）的设计允许在纯化后去除标签，避免其对蛋白功能的影响。对于表达量低的蛋白，串联多个亲和标签或结合反向纯化策略（如HaloTag的共价捕获）能显著提高回收率。
常见问题：
Q1. 如何避免His-tag融合蛋白纯化过程中的非特异性金属离子吸附？
A：可在结合缓冲液中加入5-10 mM β-巯基乙醇或0.1% Triton X-100，减少疏水相互作用；同时使用20-40 mM咪唑的预洗步骤可竞争性去除弱结合杂蛋白。
Q2. 对于易形成包涵体的融合蛋白，纯化方法应如何调整？
A：需先采用8 M尿素或6 M盐酸胍溶解包涵体，在变性条件下完成亲和纯化后，通过梯度透析或柱上复性恢复天然构象。此时建议选用对变性剂稳定的Ni-NTA树脂或GSH琼脂糖介质。
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文献和实验GST融合蛋白纯化方法 1 目的片段接入pGEX载体；2 涂板，挑单克隆，摇菌至OD600≈1.0，加入IPTG（终浓度1 mM）诱导6－8 h；3 收菌，每升菌液约以50 mL PBS重悬，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF（终浓度1 mM）； 以下步骤均在冰上操作： 4 超声破碎菌体，15000 g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1 h；5 2000 g，3min
naj2007 请教一下各位老师，在构建过表达载体的时候，VEGF和GFP是不是不可以做成融合蛋白，但是如果用不同的启动子的话，很容易丢失荧光，有没有什么解决方法。 zhujoker 可以做成融合蛋白的，即使是使用不同的启动子的话荧光也不那么容易丢失的，大不了你将荧光的启动子换成强的如CMV，EF1a之类。 kinguangjun 或者你可以用CMV-VEGF-IRES-GFP来做
，HABA 无法与生物素进行竞争，需以 NaOH 进行再生。但之后仍可使用 HABA 检验填料是否成功再生。) Strep-Tactin®/Strep-Tactin®XT 纯化操作步骤： 所有的步骤应在适合您融合蛋白的温度中进行 (4°C 至 25°C 之间)。为了获得最好的纯化效果，请依照指示的容量及比例进行操作 (如: 柱床体积、清洗缓冲液的多寡等)。当蛋白表达量少时，请勿改变其他缓冲液用量，而是加入更多的细胞提取液，以完整利用柱体中填料的载量。 下表为使用二代或三代填料，对标准纯化
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