Top-Down蛋白质组学流程全解析

Top-Down蛋白质组学（Top-Down Proteomics, TDP）是一种直接分析完整蛋白质（intact proteins）的方法，与之相对的是Bottom-Up 蛋白质组学，它通过蛋白质的酶解产物（通常是肽段）来进行鉴定和定量。Top-Down 方法可以在保持蛋白质原始状态的同时，更全面地揭示其翻译后修饰（PTMs）、亚型（proteoforms）等信息。Top‑Down 蛋白质组学可为科研人员提供最贴近真实蛋白形态的深度解析，是功能蛋白质组学、标志物研究和新药靶点开发中的利器。

 

一、样品制备

1、样本来源与质量控制

（1）组织 / 细胞：使用冷冻研磨或显微切割获取高纯度样品

（2）血清 / 血浆：通过去除高丰度蛋白增强低丰度蛋白检测

（3）重组蛋白 / 标准品：用于方法开发、定量验证

关键在于完整性保护：采用低温操作、防蛋白酶处理、迅速冷冻，防止蛋白降解与修饰丢失。

 

2、分离预处理

（1）脱盐 / 除杂：通过凝胶过滤或透析去除盐离子干扰

（2）浓缩 / 缓冲切换：确保离子化兼容性

 

二、分离系统

Top-Down蛋白质组学分析前需进行高效分离以减少干扰，常用包括：

1、反相液相色谱（RP‑HPLC）

适用于保守性较强的小至中型蛋白（<30 kDa）。优化梯度使完整蛋白以圆滑峰形进入质谱。

 

2、 正相 / 离子交换色谱（IEX）

可根据蛋白电荷状态分级，增强复杂样品中蛋白覆盖。

 

3、毛细管电泳（CIEF / CZE）

在电场作用下分离等电点蛋白，适用于高度同分异构体分析。

 

三、离子化与质谱检测

1、 离子化方式

（1）ESI（电喷雾电离）：多电荷离子适合大分子

（2）MALDI：优点是快速，但Top‑Down应用受限

 

2、 质谱仪平台

（1）Orbitrap Eclipse/HF-X：高分辨率（>120,000），质谱准确度高

（2）FT-ICR：亚ppm精度，可解析高度同位素峰

（3）QB/TimSTOF：融合QB碎裂技术，适合翻牌蛋白分析

 

四、蛋白质碎裂策略

完整蛋白需要高效碎裂才能鉴定其一级序列及修饰。常见片段如下：

1、ECD（电子捕获解离）

羧基保留能力强，适合定位磷酸化、糖基化等PTMs，其特点是 back‑bone 裂解突出 c/z 离子。

 

2、ETD（电子转移解离）

类似 ECD、能处理较高价带蛋白，兼具高通量适用性。

 

3、 CID / HCD（碰撞诱导解离）

常用于小到中等分子量蛋白的序列确认，但可能导致易失性修饰脱落，如磷酸基团。

 

4、UVPD（紫外光解离）等高级方法

提供a+x片段，序列覆盖更完整，修饰位置更精确。

整合建议：《Top‑Down 实验流程图》中，推荐“主碎裂方法选择 + 辅助方法组合”性策略，提升覆盖率。

 

五、数据采集与实时分析

现代仪器支持 DIA（Data‑Independent Acquisition）和 DDA（Data‑Dependent Acquisition）：

1、DDA：针对前体离子碎裂，有高灵敏度，但通量有限

2、DIA：按窗口无选择扫全片段，通量高但谱图复杂

 

六、Top-Down蛋白质组学数据处理与结果解析

1、预处理

（1）去噪、脱谱、重建同位素包：

（2）软件：Thermo ProSight PTM、TopPIC、TDPortal、MSPathFinder

 

2、序列匹配与 PTM 定位

（1）比对预设谱图库或 de novo

（2）可识别磷酸化、甲基化、乙酰化等位点

（3）标记“完全蛋白+PTM+剪切”的 proteoform 信息

 

3、定量 / 差异分析

（1）峰面积或基于标记法（如 TMT）进行相对定量

（2）结合统计分析检验显著性

 

4、结果可视化

（1）峰图覆盖度、谱图可视化展示、Proteoform 图谱

（2）修饰热图、Protein network整合等

 

七、应用领域拓展

1、生物标志物发现：肿瘤、神经退行性疾病中特定 proteoform 挖掘

2、药物靶标验证：大分子药物结合诱导 PTM 变化检测

3、合成生物 / 重组蛋白质量控制：质量一致性与结构验证

4、异构体功能分析：不同剪切变体下的组织特异性功能研究

 

八、百泰派克Top-Down蛋白质组学特点

1、平台优势：Orbitrap Eclipse + ETD/ECD/MS/MS 专用碎裂单元

2、流程体系：涵盖从样本到深度数据解析的全流程，一站式服务

3、定制支持：支持靶向蛋白定向方法开发（PTM、剪切异构体、高分子蛋白）

4、结果报告：提供 Proteoform 识别表格、序列修饰图谱、定量分析热图、网络图、技术可重复性评价

百泰派克生物科技凭借先进仪器、专业团队和系统化流程，致力为生命科学领域客户提供极具价值的Top-Down蛋白质组学解决方案。

 

百泰派克生物科技特色项目

 

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

 

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

 

 

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

 

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

 

 

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

 

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

 

 

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

 

 

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

 

 

百泰派克生物科技七大检测平台

 

 

 

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

5.服务3000+企业，10000+客户的选择；

6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!