EMSA/Gel-Shift 试剂盒化学发光法

货号：EM001

存储条件：1-4组分-20℃保存，其他组分可4ºC保存，一年有效。

产品组分

货号	组分名称	规格	Sample
EM001-1	EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液 (5X)	200 μL	20 μL
EM001-2	上样缓冲液 (无色, 10X)	200 μL	20 μL
EM001-3	上样缓冲液 (蓝色, 10X)	200 μL	20 μL
EM001-4	Streptavidin-HRP 偶联物	100 μL	10 μL
EM001-5	洗涤液 (5X)	250 mL	25 mL
EM001-6	检测平衡液	250 mL	25 mL
E1070-A	ECL 发光液 A	50 mL	5 mL
E1070-B	ECL 发光液 B	50 mL	5 mL
P1203	无蛋白封闭液	380 mL	50 mL

 

产品简介：

本试剂盒基于电泳迁移率变动实验（EMSA/Gel-Shift），结合化学发光检测技术，用于快速、高灵敏度地检测蛋白质与核酸（DNA/RNA）的特异性相互作用，如转录因子、核酸结合蛋白等的结合活性分析。试剂盒包含EMSA检测所需要的结合缓冲液，适用于基础研究、药物筛选及分子机制研究。

 

自备试剂

1. 探针

2. 提取用蛋白裂解液

3. 蛋白酶抑制剂

4. 带正电荷的尼龙膜或NC膜

5. EMSA电泳相关试剂

 

操作步骤（供参考）：

1. 样品制备

（1）蛋白提取

a. 细胞样本：

收集1x107细胞，加入1ml 1xPBS洗涤一次，1000rpm离心5 min 去除上清，收集细胞；加入预冷裂解液1ml，同时按比例添加蛋白酶抑制剂，重悬细胞，剧烈涡旋10秒充分混匀，置于冰上30分钟，可每10分钟充分吹打一次；4℃，12000-16000g离心15分钟，将裂解产物（上清）转移到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。

b. 动物组织：

将0.1g的组织切成非常细小的碎片，在冰浴条件下充分匀浆，用100um的细胞筛等收集细胞悬液，可加1xPBS冲洗；

4℃，1500g离心5min，弃上清收集细胞沉淀；沉淀中添加预冷的裂解液200ul（需添加蛋白酶抑制剂）可额外添加10ul DTT，重悬细胞后，剧烈涡旋10秒充分混匀，置于冰上30分钟，可每10分钟充分吹打一次；

4℃，12000-16000g离心15分钟，将裂解产物（上清）转移到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。

c. 植物组织和不易匀浆的动物组织：

去植物样本约0.2g，液氮研磨；加入500-1000ul 预冷的裂解液（添加蛋白酶抑制剂）进行裂解，为了提高裂解效率，可加入 200ul 玻璃粉（可选）按照600-800g离心力充分震荡 30min，裂解完成后 12000 rpm，离心30min，吸取上清置于新的离心管中，弃去沉淀。

d. 原核/真核表达蛋白：

诱导蛋白表达并鉴定表达形式，要求表达的蛋白为上清表达；纯化诱导表达的蛋白；

e. 考马斯亮蓝或BCA测定蛋白样本浓度；

f. 样本分装为约40ul/管，保证每管含有5-25ug蛋白，液氮速冻后-80℃保存。

注意：避免反复冻融蛋白，分装保存于 -80°C。

 

(2) 探针标记

使用生物素或荧光标记的 DNA/RNA 探针。

注意：探针需退火形成双链，避免核酸酶污染。

 

2. 结合反应

(1) 反应体系配制

根据以下表格配置不同组别的EMSA反应：

组分	实验组	阴性对照	野生型冷探针对照	突变型冷探针对照	Super-shift	终浓度
结合缓冲液 (5X)	2 μL	2 μL	2 μL	2 μL	2 μL	1x
核蛋白提取物或纯化后的转录因子	1-5 μL	-	1-5 μL	1-5 μL	1-5 μL	5-25μg
生物素 标记探针	1 μL	1 μL	1 μL	1 μL	1 μL	20 fmol
竞争性探针（野生）	-	-	-	50-200x	-	1-4pmol
竞争性探针（突变）	-	-	50-200x	-	-	1-4pmol
目的蛋白 抗体	-	-	-	-	0.5-1 μL	0.5-1ug
ddH2O	Up to 10 μL

(2) 反应条件

按照以上顺序添加各试剂，加入未标记的探针或者抗体后混匀，并在PCR仪上37℃反应20min，让冷探针和抗体优先反应；

加入标记好的探针混匀，在PCR仪上37℃反应20min。

注：a.避免剧烈震荡，防止复合物解离。

b.如需做super-shift反应需自备抗体

c.若蛋白为原核表达，经纯化后每个反应体系终含量为：25ng-75ng

d.竞争性探针野生型和突变型的使用量均为生物素标记探针的50-200倍

3. DNA-EMSA非变性凝胶电泳配置

(1) 按照以下比例配置5% 非变性 PAGE 胶，总体积10ml（可按比例扩大）

组分	体积
5X TBE 缓冲液	1 ml
ddH2O	6.5 ml
40% Acr/Bis（39:1）	1.25 ml
20% 甘油	1.25 ml
10% APS	75 μL
TEMED	5 μL

依照上述次序依次加入各溶液，添加TEMED茜需混匀，添加TEMED后需要立即混匀并灌胶。灌胶时避免气泡并添加梳齿。

注：如发现制胶时很容易出现气泡，怎可对制胶玻璃板进行硅烷化处理。

(2) 上样与电泳

每孔加入 1 μL 10X 上样缓冲液（无色） 混合样品后进行上扬。

注：有些样品会受溴酚蓝影响，建议尽量使用无色的上样缓冲液

上样时在多余的上样孔中加入10ul稀释后的1x上样缓冲液 (蓝色)用于观察电泳进行的情况。

电泳条件：

电压：100 V（恒压），建议按照10V/cm进行电泳

缓冲液：0.5X TBE缓冲液

时间：电泳至溴酚蓝迁移至距离胶底部1/4处。

注：低温电泳（4°C）可减少复合物解离，建议在电泳过程中观察电泳温度，确保温度不超过30℃，如果温度升高需要适当降低电泳电压；

 

4. 转膜与检测

(1) 转膜（尼龙膜/硝酸纤维素膜）

a. 取一张和EMSA胶大小相近的尼龙膜或NC膜，剪刀剪角做好标记，用0.5X TBE buffer浸泡10min以上；

注：尼龙膜或者NC膜请勿用手接触，全程用镊子夹取，且不能接触样品位置

b. 取2张转印用滤纸，用0.5X TBE buffer 浸泡，滤纸大小与上面转印膜的大小相近或者略大

c. 将浸泡过的膜置于浸湿的滤纸上，小心的取出EMSA胶放置于膜上；

d. 建议用湿转的方式进行转膜，转膜条件：100 mA 恒流（或约390mA），4°C 转膜约60 min（缓冲液：0.5X TBE）。

e. 转膜结束后，用镊子小心取出膜，样品面向上，放置于干燥的滤纸上，轻轻吹掉表面比较明显的液体。立即进入交联（步骤(2)）步骤。

注：

a. 转膜时间建议在30-60 min，如胶比较厚则应当适当延长转膜时间；

b. 结合膜的表面一定不能干燥!

c. 采用半干转膜仪建议按照390mA，30min。

(2) 交联

a. 利用紫外交联时建议交联条件为：120 mJ/cm²，选择紫外波长254nm，45-60s。

如无紫外交联仪可以使用普通的手提紫外灯进行交联，在距离膜3-375px的位置照3-15min，最佳交联条件需要根据标准品咨询过摸索；

b. 交联完成后进行检测，也可用保鲜膜包裹膜后置于室温干燥条件存放，可存放3-5天再进行检测。

(3) 封闭与孵育抗体

a. 封闭：取封闭液 (P1203) 15ml，加入适当容器中（如抗体孵育盒），再加入交联后的尼龙膜或者PVDF膜 室温摇育 15min。

注：确保封闭液是完全溶解的状态再使用。

b. 取7.5ul Streptavidin-HRP稀释于15ml 封闭液（按照1:2000稀释），将封闭后的膜加入封闭液中，置于摇床（水平或者侧摆皆可）室温孵育15 min。

注：Streptavidin-HRP稀释液可以重复使用3-4次，建议保存于-20℃，1月内使用完。

c. 洗涤：将5X 洗涤液25ml用蒸馏水或者milli Q稀释至 1X （稀释后体积25ml），取稀释后的洗涤液20ml洗膜，洗膜4 次（每次 5 min）。

d. 将膜转至含有20-25ml 检测平衡液的孵育盒中，在摇床上缓慢摇动5 min。

(4) ECL 显色

a. 取ECL发光液A液和B液各5ml按 1:1 混合 ECL A/B 液制成发光工作液。

注：发光液必须现用现配。

b. 将检测平衡液中的膜取出用吸水纸吸掉过多液体，置于保鲜膜或者干净的容器内，在膜表面添加发光工作液至覆盖全部的膜，室温静置2-3 min；

c. 将膜放于2片保鲜膜或者其他适当透光薄膜中间病故定于压片暗盒内部，用X光胶片压片1-5 min，显影定影，或者直接用化学发光图像分析系统中扫描成像。

 

三、注意事项

1、探针设计时要确保探针包含蛋白结合位点，长度建议 20-40 bp。

2、本产品仅限专业人员用于科学研究，不得用于临床诊断或治疗。

3、为了您的安全和健康，请佩戴一次性手套进行操作。