人神经角质纤维酸性蛋白（H-GFAP）ELISA 定量检测试

人神经角质纤维酸性蛋白（H-GFAP）ELISA 定量检测试剂盒

1. 将浓缩洗涤液用蒸馏水做 10 倍稀释（如有结晶析出，需37℃溶解后再稀释）配置成工作洗涤液。
2. 取出酶标板在室温放置、回温。标准品各浓度做平行两孔，50 μL/孔加入酶标板中。加待检样品、内部参比（建议做平行孔），50 μL/孔。然后将酶标记抗H-GFAP抗体用酶标抗体稀释液做 1:100 稀释（酶标记抗体用多少稀释多少，现用现配）加入各反应孔、100 μL/孔，此时各孔内液体总体积为150 μL。加样过程须在 15 min 内完成。
3. 置37℃避光反应 1 h，孵育完成后弃反应液，用工作洗涤液洗涤四遍，拍干。
4. 用移液器加 TMB 底物显色液（使用前恢复至室温） 100 μL/孔，37℃避光反应 15 min，请勿震荡。
5. 用移液器加终止液 50 μL/孔，轻微震荡混匀。
6. 在酶标仪 450 nm 波长处读数（603nm作为参比波长）。

结果判定

1、实验结果需满足以下参数：

0ng/mL OD值<0.1；32ng/mL OD值>1.0；拟合曲线R2≥0.98。
检测限：零浓度标准品加上两倍的标准差（20 个零孔计算值），本试剂盒检测限计算为 0.21 ng/mL 。定量限为标准曲线检测下限1 ng/mL。

2、在EXCEL里面以标准浓度为横坐标，消零 OD 值为纵坐标作散点图，添加趋势线，再显示曲线方程和R²值，将检测样品 OD 值消零处理后带入直线方程计算对应的浓度。

3、判定：

在标准曲线中，设GFAP浓度 0-16 ng/mL 为区间A；GFAP浓度16-32 ng/mL 为区间 B； GFAP浓度大于32 ng/mL 为区间C。

3.1  如测得的 OD 值小于标准曲线中 2 ng/mL对应OD值，则GFAP含量测定结果计为小于2 ng/mL。
3.2  如不同稀释浓度的样本测得的 OD 值均位于区间 A，则最终结果计算取其最低稀释度的测定值。
3.3  如不同稀释度的测定值均位于区间 B 或同时位于区间 A 和 B 或同时位于区间 B和 C，则取其最接近OD 16 ng/mL 的测定值。
3.4  如不同稀释度测定值均位于区间 C，则需将样本做进一步稀释测定，使其测定值居 2 – 32 ng/mL 所对应的 OD 值区间，计算方法按上述 3.2 – 4。
3.5  如高稀释度测得 OD 高于低稀释度或未稀释的样本 OD，则可能是操作失误或样本中 GFAP含量过高（HOOK 效应），需重试或调整稀释度。
3.6  最终结果要考虑稀释因素（实际含量＝计算值×稀释倍数）。