HPLC如何检测蛋白质纯度？原理与操作流程全解析

蛋白质纯度是影响下游实验可靠性和产品质量的核心指标。高效液相色谱（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）以其卓越的分离能力和定量精度，成为蛋白纯度检测的重要手段。本文将解析HPLC检测蛋白质纯度的原理、操作流程及优化策略。

 

一、HPLC检测蛋白质纯度的原理

HPLC利用固定相与流动相间的相互作用差异，将样品中不同组分分离，进而定量分析目标蛋白的纯度。根据蛋白的理化特性，常用HPLC方法包括：

1、尺寸排阻色谱（SEC）

 

• 原理：通过多孔填料对蛋白质分子的排阻作用实现分离。分子量较大的组分先洗脱，较小组分后洗脱。
• 应用：适用于检测蛋白聚集体、降解产物等高分子杂质。

 

2、反相色谱（RP-HPLC）

 

• 原理：依赖蛋白疏水性与固定相（如C18柱）间的疏水作用力分离。疏水性较强的组分与固定相结合更紧密，延迟洗脱。
• 应用：用于分析蛋白纯度、结构完整性，特别对疏水区结构变化敏感。

 

3、离子交换色谱（IEX）

 

• 原理：基于蛋白表面电荷与带相反电荷的固定相（阳离子或阴离子交换剂）间的静电相互作用实现分离。通过调节流动相中盐浓度或pH梯度，分离不同电荷异构体。
• 应用：适合检测蛋白的电荷异质性及杂质含量。

 

二、蛋白质纯度HPLC检测的标准操作流程

1、样品准备

 

• 将蛋白样品溶解于适当缓冲液（如PBS），确保完全溶解。
• 采用0.22 μm过滤器除去微粒，防止堵塞色谱柱。
• 控制进样浓度在系统建议范围（通常为0.1–5 mg/mL），避免柱过载。

 

2、色谱系统准备与条件设定

 

• 根据目标蛋白选择合适的色谱柱（SEC、RP、IEX）。
• 配制并过滤流动相，确保与样品及柱兼容，防止析出物堵塞系统。
• 设定流速、柱温（通常为25–40℃）及检测波长（常用280 nm）。

 

3、系统平衡与样品进样

 

• 使用流动相平衡色谱系统（约10–30分钟），确保基线稳定。
• 采用自动进样或手动进样，注意进样体积的精准控制。

 

4、洗脱及检测

 

• SEC通常采用等度洗脱，保持流动相组成恒定。
• RP-HPLC和IEX多采用线性或阶梯梯度洗脱，提高分辨率。
• 通过紫外检测器（UV）监控洗脱峰，绘制色谱图。

 

5、数据分析与纯度计算

 

• 提取色谱图中主峰（目标蛋白）及杂质峰面积，计算纯度百分比。通用公式：纯度（%） = （主峰面积 ÷ 所有峰面积总和） × 100
• 为确保结果准确可靠，建议进行多次进样，并结合自动积分与峰识别功能分析。

 

三、提高检测准确性的关键要点

 

• 合理选择色谱柱：依据蛋白的分子量、疏水性或电荷特性，选择匹配的分离模式。
• 优化流动相组成：保证流动相的pH、盐浓度与蛋白稳定性相容，减少样品降解或非特异性结合。
• 系统维护与柱保护：定期清洗流路和色谱柱，避免残留物污染影响分析结果。
• 梯度洗脱策略：对于复杂样品，可通过优化梯度条件实现更高分辨率分离。
• 定量结果验证：通过多次独立进样、使用外标或内标法验证数据稳定性与准确度。

 

HPLC以其高分辨率、良好重复性和高灵敏度，已成为蛋白质纯度检测不可或缺的核心技术。深入理解其原理与操作流程，合理选择色谱模式并优化参数，是确保实验成功的关键。百泰派克生物科技凭借先进的色谱分析平台和经验丰富的技术团队，能够提供从方法开发、系统搭建到数据解析的一体化解决方案。我们结合高分辨率分离技术与严格质量控制体系，为科研人员与企业客户提供高质量、可重复、数据可追溯的蛋白纯度检测服务。

 

百泰派克生物科技特色项目

 

一、蛋白测序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos质谱仪及岛津公司埃德曼降解测序系统对蛋白质序列进行分析，提供基于质谱的蛋白测序分析服务，包括对蛋白质的氨基酸组成分析，N端测序，C端测序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白质N端序列分析服务。对于未知理论序列的蛋白质，提供基于从头测序法的蛋白质从头测序服务，对蛋白序列进行分析。

 

※服务优势：

1.采用目前世界上先进的质谱仪器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可实现对所测定靶蛋白序列 100% 的覆盖;

3.可测定蛋白N端多达 70个氨基酸序列;

4.可测定多种形式的样品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白条带;

5.样品用量低: 蛋白样品仅需 5-10ug，即可完成检测;

6.测序不受N端封闭，PEC和和糖基化等N端修饰的影响。

 

 

二、蛋白质组学

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，提供定量蛋白质组学、靶向蛋白质组学、多肽组学、翻译后修饰蛋白组学等多种蛋白质组学分析服务。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白质组学服务，助力微量样本蛋白组学、大样本群医学及高通量修饰组学等研究工作。

 

※服务优势：

1 .高通量定量蛋白分析:多对照组大规模实验分析，发现新的生物标记物;

2.体内体外多种蛋白质标记方法，适用于分析组织、细胞、血液等多种样品;

3.质谱分析灵敏度高，实验结果重复度高;

4.可检测较低丰度蛋白，线性范围广;

5.专业生物信息学分析，分析更系统准确。

 

 

三、单细胞质谱流式技术分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm质谱流式系统进行单细胞质谱流式技术分析，采用金属元素标记物（通常是金属元素标记的特异抗体）标记细胞表面和内部的分子，然后用流式细胞原理分离单个细胞，再用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析单个细胞的原子质量谱，最后将原子质量谱数据转换为细胞表面和内部的信号分子表达量。

 

※服务优势：

1.技术先进，填补技术空白

采用金属标记抗体技术，避免了传统流式荧光通道少且易相互影响的问题。可在单细胞层面上对多种指标同时进行表征，百泰派克生物科技可做到同时检测51个目标蛋白。

2.分析数量大，成本较低

单细胞RNAseq受成本等因素限制，所有样本细胞汇总的分析数目一般在2x10^4个左右，而流式质谱技术一次（单样本）就可分析至少10^5的细胞，实现了数量级的提高，且成本不高于单细胞RNAseq。

3.应用前景大

①流式质谱结果可以给出细胞亚群的变化，在临床诊断、疾病机制研究等方面具有极大的研究前景；

②将金属标签技术与其他技术结合会有新应用方向。除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰；

③可检测细胞存活率、细胞大小、mRNA转录子表达量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

 

 

四、基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现

百泰派克生物科技的基于高精度质谱的免疫多肽组学分析及新抗原发现一站式解决方案包括我们专有的、高度敏感的免疫肽富集和鉴定方案。我们能够帮助您实现10,000个以上I型多肽和10,000个以上II型多肽的鉴定和识别。通过我们优化的高通量免疫多肽组学分析平台进行免疫肽组学分析，可从最小的样品材料中进行可重复的识别和定量。该服务可以应用于大规模的研究，旨在助力科研工作者寻找癌症、免疫疾病及传染病的解决方案，深入挖掘未知的靶标。

 

 

五、生物药物表征

百泰派克基于高分辨率质谱技术，MALDI TOF，高效色谱分离技术，提供一系列完善的生物药物分析方案，从蛋白质、多肽、抗体、疫苗等生物制品的氨基酸组成和一级结构分析，到产品变异性和纯度分析。旨在提供优质生物药物分析服务，帮助生物医药生产商提高生物药物品质。

 

 

百泰派克生物科技七大检测平台

 

 

 

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物质谱多组学优质服务商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。

1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；

2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；

3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；

4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；

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