STAR-Click新生转录本捕获试剂盒

产品简介

本试剂盒使用5-乙炔基尿嘧（EU）标记活细胞中的新生RNA，然后通过点击化学反应，使新生的RNA标记上生物素，再通过链霉亲和素磁珠特异性捕获新生的RNA，捕获的新生的RNA可用于后续的qPCR、RNA测序等应用。结合实验时间设计，能够对新生成的RNA进行定量分析，同时能够研究RNA转录水平和降解问题。

产品特点

l 可进行转录组--RNA合成及降解的动力学分析；

l 获取控制基因表达的新见解；

l 建立刺激诱导的RNA转录和降解之间序列改变的模型；

l 通过比较新生转录水平，显著提高差异表达的分辨率；

l 操作简单，无需繁琐的Pull-down实验；

l 适用于活体动物、植物以及活细胞样本。

产品组分

试剂盒	组分名称	FS-L1004-01	FS-L1004-02	FS-L1004-03
试剂盒1	Click-Buffer-2	120 μL	240 μL	960 μL
	保护剂	600 μL	1200 μL	4800 μL
	链酶亲和素磁珠	240 μL	480 μL	1920 μL
	2×Wash Buffer	1320 μL	2640 μL	10560 μL
	溶液A	960 μL	1920 μL	7680 μL
	溶液B	960 μL	1920 μL	7680 μL
试剂盒2	EU (1 M)	100 μL	200 μL	800 μL
	生物素	36 μL	72 μL	288 μL
	硫酸铜	36 μL	72 μL	288 μL
	Click-Buffer-1	72 μL	144 μL	576 μL

储存及运输条件

试剂盒1：2~8℃存储，冰袋运输；试剂盒2：-25~ -15℃保存，≤ 0℃运输。

注意事项

实验过程中，请穿实验服并佩戴口罩和一次性手套，在洁净实验区域内操作，同时注意使用无RNA酶的耗材；

试剂盒使用前需完全解冻并混匀后使用，待用期间请将试剂放于冰上；

本产品仅作科研用。

材料准备（试剂盒中不提供）

1. RNA提取试剂盒，TRIZOL，异丙醇；

2. RNA质控：Nanodrop、Agilent 2100 Bioanalyzer或其他等效产品；

3. 其他材料：磷酸盐缓冲液、无水乙醇、无菌超纯水、无菌无酶水，低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

实验流程

 

Fig.1 STAR-Click新生转录本捕获试剂盒流程示意图。

操作步骤

1 培养及RNA提取

1. EU孵育（不同样本选取不同条件）

1.1 细胞样本EU孵育

细胞密度在70-90%或细胞密度达到实验设计的需求，进行EU孵育。使用完全培养基进行稀释EU，常见细胞EU的使用终浓度为1 mM，孵育2小时。或根据文献报道，也可调整EU终浓度以及孵育时间。初次实验，可按照推荐EU剂量和时间进行预实验；如T25瓶的细胞将其培养基去除后，将配置好的含有1 mM EU培养基加入到培养瓶中进行孵育2小时^*。按照步骤2进行后续实验。

下表为推荐测试的EU剂量和时间：

EU浓度（mM）	孵育时间（h）
2	2
1	4
0.5	6-8
0.1	10-24

*肺癌细胞（95D、H1573、H209、H226、H292、H460）、肝癌细胞（HepG2、Huh7、SMMC-7721B、Hep3B、PLC/PRF/5、SK-HEP-1、BEL-7402、Mahlavu、Focus）、乳腺癌细胞（MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1937、SUM149、MCF-7、T47D、CAMA-1、ZR-75-1、HCC1954、SK-BR-3、Hs578T、BT-594）、卵巢癌细胞（A2780、SKOV3、ES2、HEY、CAOV3、OVCAR8、Anglne、UWB1.289）、宫颈癌细胞（HeLa、SiHa、CaSki、C-33A、ME-180、HT-3、MS751、DoTc2 451、SW756、ME-180）、胃癌细胞（AGS、MKN-45、MKN-28、NCI-N87、SNU-1、HGC-27、NUGC-3、OCUM-1）、结直肠癌（HCT-116、HT-29、SW480、SW620、Caco-2、LoVo、DLD-1、COLO 205、RKO、LS 174T、LS 180、T84）、肾癌细胞（786-O、Caki-1、Caki-2、ACHN、769-P、A498、OS-RC-2）、神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y、SK-N-SH、IMR-32、LAN-1）、成骨细胞（SJSA-1、TE-85）、神经细胞（U87、NSC-13、U251、PC12）等常见的癌症细胞和非癌症细胞。

1.2 动物组织EU孵育

根据动物体体重进行注射或灌胃，可以按照200-400 mg/kg的用量，把EU用PBS配制成一定浓度，进行注射或灌胃。具体用量与所用动物的种类、体重以及使用方式有关，可以参考相关文献，如初次使用时建议对EU的使用浓度进行一定的摸索，或者直接使用200 mg/kg的浓度进行测试，4小时后^*或根据特定实验确定的适当时间后，快速处死小鼠，取出所需的组织。按照1中步骤2进行后续实验。

*实验验证过小鼠、大鼠、黄鼠、兔子等常见动物模型。

1.3 植物样本EU孵育

根据植物体的培养环境进行添加EU进行孵育，用量可以参考相关文献进行，对于液培可以在培养基中加入EU使其终浓度为0.5 mM，培养6-8小时^*，可根据自己方法提取RNA，提取完RNA后，进行第2步点击反应后续实验。

*实验验证过水培和土培的人参、多种花卉和粮食作物等。

2 RNA提取

2.1 对于培养的细胞样本，去掉培养基，用1 ml TRIZOL将细胞裂解，置于无酶EP管中，室温静置5 min；对于植物以及动物样本，取到相应组织后，用无酶PBS清洗组织2-3次，将其置于1 mL TRIZOL中使用研磨仪器研磨直至看不到组织块，置于无酶EP管中，室温静置5 min；

2.2 加入200 μL氯仿，涡旋混匀，室温静置3 min；

2.3 14000g 离心5 min，取上清，加入等体积异丙醇，涡旋混匀；

2.4 冰上静置10 min，14000g离心20 min，弃上清；

2.5 用75%的乙醇清洗沉淀，14000g离心5 min；

2.6 重复步骤6；

2.7 弃上清，待乙醇挥发后，加入50 μL DEPC水溶解RNA。

2.8 rRNA去除，推荐启衡星核糖体RNA去除试剂盒进行rRNA的去除（这一步为推荐选项，rRNA去除可以提高目标RNA的检测灵敏度以及减少测序量）。

3点击反应

3.1 点击反应液配制

成分	体积/μL
生物素	2.5
硫酸铜	3
Click-Buffer-1	6
Click-Buffer-2	10
保护剂	50
PBS	928.5
Total	1000

3.2 每个样本中加入150 μL点击反应液，涡旋混匀；

3.3 冰上静置30 min；

3.4 向点击反应液中加入1 ml TRIZOL，涡旋混匀；

3.5 重复RNA提取过程（TRIZOL法提取）。

4准备链霉亲和素磁珠（SMB）

4.1 涡旋振荡使链霉亲和素磁珠充分悬浮，不要离心，以防磁珠沉降；

4.2 每个样品取20 μL重悬好的磁珠到一个新的EP管中。对于多个样品所需SMB磁珠的清洗，可一起进行，如将6 个(120 μL)或12个样品(240 μL)的磁珠分装在一个管中进行清洗。每20 μL链霉亲和素磁珠加入20 μL的2×Wash Buffer混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；

4.3 取下装有磁珠的EP管后，每20 μL链霉亲和素磁珠加入40 μL的2×Wash Buffer混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；

4.4 同步骤4.2操作，每20 μL链霉亲和素磁珠使用40 μL溶液A清洗2次，接着使用40 μL溶液B清洗2次；

4.5弃上清后，向磁珠（每个样）中加入50 μL的2×Wash Buffer重悬；

5新生RNA捕获

5.1向第3步中得到的RNA，每个样本加入50 μL准备好的链霉亲和素磁珠；

5.2涡旋混匀后，室温孵育20 min，将EP管置于磁力架中2-3 min，待磁珠吸附完成后，弃上清；

5.3每个样本加入20 μL 的1×Wash Buffer，混匀后置于水平旋转仪上低速旋转1 min后，置于磁力架上待磁珠吸附完成后，弃上清；再重复2次。

5.4 此时新生RNA已经被链霉亲和素磁珠捕获，此时捕获的新生RNA可以用于下游的应用，如RT-qPCR，RNA-seq等。