71710 Script III All-in-one RT

Script III All-in-one RT Mix With dsDNase

（Perfect for qPCR）

目录号:71710

产品内容

保存条件

-20℃保存，有效期 12 个月。

产品简介

Script III All-in-one RT Mix With dsDNase是Script III RT Kit WithgDNA Eraser的升级版，只需一步操作， 仅需15分钟就可以同时完成基因组清除与逆转录反应，操作方便快捷，逆转录产物兼容染料法和探针法qPCR，用于检测高拷贝或低拷贝基因。

本品采用第三代高效逆转录酶和热敏型dsDNase，针对qPCR进行特别优化oligo dT和N6随机引物配比，使cDNA合成可从RNA转录本的各个区域起始并具有相同的逆转录效率，zui大程度保证了qPCR结果的真实性和可重复性。

其中5 x All-in-one RT Mix为一管式逆转录预混液，含有逆转录所需的所有试剂（Script III Hˉ RTase、RNase Inhibitor、Random primers、OligodT Primer、dNTP Mixture、RT Buffer）。

注意事项

1． 避免 RNase 污染。

2． 为保证逆转录成功，建议使用高质量的 RNA 样品。

3． 20μl 逆转录反应体系建议加入不超过 1μg 的 Total RNA。如果目的基因的表达量非常低，最多加入 5μg Total RNA，否则，RNA 量过高，可能会超出后续 qPCR 的线性范围

4． 本产品适用于包含 Ploy (A)结构的真核生物 mRNA 和不包含 Ploy (A)结构的原核生物RNA、真核生物rRNA和tRNA等模板，但不适用于miRNA等小 RNA 模板。

5． 5x All-in-one RT Mix 和 dsDNase 含有高浓度甘油，比较粘稠，容易吸附在管壁和吸头外，导致损失，用前请点甩离心后取用。5x All-in-oneRT Mix 和 dsDNase 内包含的酶过量，即使每次分别按照 3.8 μl、0.9 μl使用，也不影响使用效果。

6． 建议使用 0.2ml RNase-free PCR 管在冰上配制反应液，并用 PCR 扩增仪精准控温。

第一连 cDNA 合成 (以 20 μl 反应体系为例)

重要提示：操作前，请将各组分轻弹混匀，点甩离心后置冰上备用。

1． 反应体系的配制

于冰上，在PCR管中，加入以下组分：

用移液器轻轻吸打，充分混匀，点甩离心收集至管底。

2． 逆转录反应

① mRNA模板来源于真核细胞(植物、动物)，含有Poly(A)尾结构：42℃孵育15min；

② mRNA模板来源于原核细胞(细菌)、病毒，不含Poly(A)尾结构：25℃孵育10min；42℃孵育15 min。

注意：如果模板具有复杂二级结构或高GC区域，设置反应程序：

42°C孵育2 min（去除gDNA），50°C孵育15 min (逆转录)，有助于提高产量。

3． 终止反应

85°C加热5 sec，失活RTase和gDNA Eraser。

逆转录产物可立即用于qPCR反应，或保存于-20°C，并在半年内使用；长期存放，请分装后存于-70°C。

qPCR

建议取1~2μl cDNA产物原液作为20μl qPCR反应体系的模板。如果基因表达量比较高，请根据实际情况适当稀释cDNA模板后使用。

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