DNA Pull Down Kit(Animal)

一、实验原理

DNA pull down技术是体外研究DNA与蛋白质互作的有力工具。该技术针对目标区域设计特异性DNA探针并经过脱硫生物素标记，标记后探针可以和偶联在磁珠上的链霉亲和素亲和结合，再与总蛋白提取物进行孵育，有互作的蛋白质可以和DNA探针特异性结合，形成磁珠－DNA探针－蛋白复合物，洗涤去除非特异性结合的蛋白质，再经过洗脱得到目的DNA探针－蛋白质复合物，最后通过Western Blot或质谱(MS)鉴定蛋白质类型。其原理图如下图：




二、实验流程图






三、实验对照组设置流程图

一、总蛋白提取

1、细胞样本

（1）洗涤：预冷的1mL PBS洗涤样品（约 2×10⁷个细胞）2次，最后一次尽量吸干PBS；

（2）裂解：根据细胞量加入980uL Lysis buffer、10uL Protease inhibitors (100×)、冰上充分裂解30min，每5min涡旋一次，10 s/次；

（3）用超声波细胞破碎仪超声5min，功率20%，超声3s，间歇3s，冰浴超声；

（4）离心：4°C，12000rpm，10min，收集上清。

2、组织样本

（1）研磨：取新鲜组织或低温组织（约0.3g)，置于预冷的研钵中，用液氮进行研磨成粉末，放至新的EP管中；

（2）裂解：取980uL Lysis buffer、10uL Protease inhibitor(100×)混匀作为裂解液，吸取800uL裂解液加入研钵，在冰上继续研磨5-10min至样品成细腻的匀浆状，转移至新的EP管中，再向研钵中加入剩余的190uL裂解液收集残留的样品，同样转移至EP管；

（3）装有样品匀浆的EP管在冰上充分裂解30min，每5min涡旋1次，10s/次；

（4）用超声波细胞破碎仪超声8-10min，功率20%，超声3s，间歇3s，冰浴超声；

（5）离心：4℃，12000rpm，10min，收集上清，再向上清中加入Lysis buffer补充体积至1mL，混匀。

注：蛋白提取整个过程都在冰上操作，减少高温造成的蛋白降解；超声过程中最好不要有气泡产生，减少蛋白降解。裂解后的总蛋白放在-20℃保存。

 

二、磁珠准备及洗涤

（1）将Nucleic-Acid Compatible Streptavidin Magnetic Beads从4°C冰箱取出，上下颠倒多次混匀磁珠储存液，分别取30uL到2个1.5mL EP管中，记为对照组和实验组，置于磁力架上静置1min以分离磁珠，弃上清；

（2）对照组和实验组各加入500uL Nucleic dilution buffer，重悬磁珠，置于磁力架上1min，弃上清，该步骤重复3次。

 

三、磁珠结合DNA

（1）实验管加入300pmol生物素标记的DNA探针，对照管加等量不带生物素标记的DNA或不加，用Nucleic dilution buffer补充体积至500uL，静音混合仪上室温孵育2h；

（2）将对照管和实验管从静音混合仪中取出，置于磁力架上静置1min，弃上清；

（3）对照管和实验管各加入500uL Nucleic dilution buffer，重悬磁珠，置于磁力架上1min，弃上清，该步骤重复3次。

 

四、DNA－磁珠结合蛋白

（1）对照管和实验管各加入450uL提取的蛋白，用Protein dilution buffer补充体积至1mL，静音混合仪上4°C孵育过夜（约16h)，此处预留100uL裂解液作为Input组；

（2）对照管和实验管从静音混合仪中取出，置于磁力架上静置1min，弃上清；

（3）加入1mL Protein dilution buffer，重悬磁珠，置于磁力架上静置1min，弃上清，该步骤重复5次。

 

五、洗脱复合物

（1）对照管和实验管均加入100uL Elution buffer，混匀后沸水浴8-10min，置于磁力架上静置2min，取上清到新的EP管中，即为pull down产物，标记为对照组和实验组，2管各加入20uL 6× Loading buffer，沸水浴8-10min；

（2）预留Input组的100uL裂解液，也加入20uL 6× Loading buffer，沸水浴8-10min；

（3）对照组、实验组和Input均-20°C保存备用。后续做银染、质谱鉴定或WB检测。