慢病毒包装试剂盒

产品简介

慢病毒包装试剂盒（Lentiviral Packaging Kit） 由优化的慢病毒包装辅助质粒混合物（Lentiviral Mix）、 表达 eGFP 蛋白的对照质粒和高效转染试剂（Max Transfection Reagent）组成 ，可以兼容第二代和第三代的慢病毒包装质粒 ，包装时间周期短（一周之内即可拿到纯化好的高滴度慢病毒）、病毒滴度高 ，可应用于针对不同基因和药物靶标的临床前细胞实验和动物实验。

 

产品规格

 

组分信息

 

储存条件

冰袋运输。Max Transfection Reagent（C230129-C）于 4℃保存 ，其余组分(C230129-A、C230129-B)均 于-20℃保存。保质期一年有效。

 

注意事项

1.     为了您的安全和健康 ，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

2.     本产品仅用于科研。

 

使用说明

1. 慢病毒包装所需其他材料（选用）

1)     DMEM

2)     FBS

3)     Penicillin-Stretomycin

4)     HEK 293T/293FT：慢病毒包装及低度检测所用工具细胞

5)    Antibiotics：用于稳定转染细胞株筛选 ，如 Puromycin ，G418 等

6)     Competent cells

2. 病毒包装前的准备

1)     慢病毒表达载体：包含病毒包装 ，侵染和将病毒重组基因整合到基因组 DNA 中以便表达目的基因或 者 shRNA 的基本元件。

2)     DNA 溶液的制备：质粒 DNA 溶于无菌的 TE 或 ddH2O 中 ，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证 所提质粒 DNA 的 A260/A280 在 1.8～2.0 之间。

3)     细胞状态： 良好的细胞状态对病毒的包装至关重要 ，避免细胞培养基有细菌、真菌或支原体的污染， 尽量使用传代次数较少的细胞 ，如果细胞是刚复苏的话 ，最好传两代之后再包装。

      4)     慢病毒包装：Arcegen 生物慢病毒载体表达系统由 pGMLV 慢病毒载体和 Lentiviral Mix 质粒组成。

pGMLV 慢载体中含有 HIV 的基本元件 5’LTR 和 3’LTR 以及其他辅助元件，例如 WPRE 和 cPPT/CTS 等。Arcegen 可以根据不同实验目的针对 pGMLV 载体改造以进行启动子活性研究、基因表达研究、 RNA 干扰等研究。Lentiviral Mix 能够表达病毒包装需要的各种必需成分如：gag 基因 ，编码病毒主  要的结构蛋白；pol 基因 ，编码病毒特异性的酶；rev 基因 ，编码调节 gag 和 pol 基因表达的调节因 子；还含有单纯疱疹病毒来源的 VSV-G 基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白，可以兼容第二代和第

三代的慢病毒包装质粒。

3. 慢病毒包装

制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其辅助包装原件载体质粒 ，重组质粒载体和辅助质粒载体分别进行 高纯度无内毒素抽提，使用 Max Transfection Reagent 进行共转染 293T 细胞，转染后 18 h 更换为完全培 养基，培养 48 h 后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液，在 293T 细胞中测定病毒滴度。在一定滴度范围内的慢病毒颗粒可以满足大部分体内体外实验需求。

1)     293T 细胞分盘：转染前一天，将已经长好的细胞以合适比例传代到 10 cm 培养皿中，当细胞长到~80% 时准备转染。

2)     转染前换液：转染前 1~2 h 将需要转染的细胞换新鲜的培养基 ，12 mL/10 cm 皿。注意：293T 细胞 贴壁性不是很好 ，换液时应小心滴加尽量避免冲起细胞。

      3)     转染：取无菌的 1.5 mL EP 管或 15 mL 离心管 ，按下列组分配制反应体系：

混匀后 ，室温放置 18 min~20 min 后 ，均匀滴加到提前换过液的培养皿中 ，后置于 CO2 培养箱中培养。

4)     换液：转染 18~20 h 后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中（注意：此时培养基中已含 有少量的病毒，必须经处理后才能丢弃，所用的移液枪头等必须经消毒液浸泡处理后才能丢弃），然 后加 15 mL 新鲜的培养基（也可根据实验要求换为无血清的 DMEM）继续培养。

5)     病毒收集：换液 48 h 后 ，吸取细胞上清液于 50 mL 离心管，4℃ ,  500 g 离心 5 min ，上清液用 0.45 μm 滤器过滤后转移到新的离心管中。此时上清液中的病毒颗粒可以直接去检测滴度或者感染目的细 胞 ，如果对病毒的滴度及纯度有较高要求 ，可对上清液进行浓缩与纯化。

      6)     病毒分装与保存：将病毒以 40~50 μL 分装 ，后保存于-80℃。