Western溶液套装(封闭液、洗涤液、一抗和二抗稀释液)，

【原创】暗室实验（化学发光底物检测方法）及Western Blot实验优化方法

检测；再次检测结果仍为阴性，证明底物丧失活性。 暗室实验结果阳性： 认为二抗及底物活性良好； Western Blot 系统需要进一步优化 优化抗原和抗体浓度的斑点杂交方法：斑 点 杂 交 方 法——优 化 抗 原 和 抗 体 浓 度 对于一个给定的抗原，最佳的抗体浓度依赖的抗原和抗体本身。抗原和抗体的亲和力，以及一抗与二抗的特异反应都是不同的。最优抗原和抗体浓度可通过免疫印迹实验中使用不同浓度的抗原和抗体作用确定。另外，更快和更简单的方法是进行斑点印迹实验。以下是使用超敏感信号底物进行

【专题讨论】新手做WB的几张片子，请各位高人指点。

V转移25-30分钟。转移后的凝胶放到考马斯亮蓝R-250中染色，无明显条带显示表明转移效果较满意。 3.3 封闭 在25℃条件下，PVDF膜放入封闭液中（封闭好，以防液体挥发），以每分钟60转 恒温摇床上振荡60分钟。 3.4 一抗结合 依据抗体说明书的有效浓度，使用PBST和封闭液（1：1）来配置一抗，混合均匀。（例如膜为4×7.5cm2，配制4ml GAP-43(1:400)：2ml封闭液+2mlPBST+10ul抗体） 将PVDF膜放在一抗中。4?C孵育过夜

western-blot实验方法

1、试剂耗材的准备：（1）转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl，39 mM 甘氨酸，0.037% SDS，20%甲醇）：（2）10 × 丽春红染液：（3）TBS 缓冲液：（4）TBST 缓冲液（含20%Tween20 的TBS 缓冲液）：（5）封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液）：（6）一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或TBST 进行稀释。（7）底物显色液ECL，4℃ 避光保存，现用现配。（8）显影液和定影液用水稀释10 - 20 倍于铝盒中，可多次使用。室温避光存放