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- EK-Bioscience
- MMY1243
- 2025年10月30日
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2ug
pTYB1载体pTYB1质粒pTYB1图谱是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。pTYB1载体pTYB1质粒pTYB1图谱带有一个或一个以上的选择性标记基因和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列pTYB1载体pTYB1质粒pTYB1图谱去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。
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文献和实验*发表【中文论文】请标注：由上海酶研生物科技有限公司提供；
*发表【英文论文】请标注：From Shanghai EK-Bioscience Biotechnology Co., Ltd.
一、导论 已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤: 细菌培养物的生长。 细菌的收获和裂解 质粒DNA的纯化。 (一)细菌培养物的生长 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。现在使用的许多质粒载体(如pUC系列)都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。 此时，不必造反性地扩增质粒DNA。然而，较长一代的载体(如pBR
1、质粒的概念 质粒（Plasmid）是一种存在于细菌、酵母等微生物细胞中的小型环状双链 DNA 分子，能够独立于宿主染色体进行自我复制，并通常携带对宿主生存非必需但具有特定功能的基因（如抗生素抗性基因）。质粒是分子生物学和基因工程中最重要的工具之一。 质粒根据其用途可以分为多种不同的类型，如用于保存序列信息的克隆质粒（如：pUC 系列质粒），用于表达蛋白的质粒（如哺乳动物细胞表达所用的 pcDNA3.1 系列质粒），用于基因编辑的质粒（如哺乳动物细胞基因编辑所用的 espCas9-2A
) 克隆困难怎么办？ 对于大片段载体构建实验而言，难点在于片段扩增效率低、重组 / 连接困难、质粒稳定性差、容易发生断裂等。需针对这些痛点，从技术路线选择、实验细节优化两方面制定策略，具体方案如下： ①建议首先选择「分段克隆 + 拼接」 策略，降低连接难度； ②大片段克隆的关键在于长片段的扩增，所以需要从源头保证实验成功率，即保证模板完整度，在扩增前确保模板未发生降解；其次优化 PCR 体系，比如选择长片段专用 PCR 酶，通过梯度测试选择最佳模板上样量及退火温度等； ③避免高拷贝载体（如 pUC
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