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文献和实验水洗脱就是降低盐浓度,洗脱浓度为0.X的硫酸铵,pHX 经过这一步后,GCSF的纯度可以接近90%,活力达到药典要求。 5.2 缓冲液置换 为了进行下一步离子交换,进行缓冲液置换。 用GE公司G25,不要吝惜填料,买一个500克包装,几千元,装一个脱盐柱,实验室里受用无穷。 缓冲液为醋酸缓冲液,50mM就行,pH=x.X 5.3 离子交换层析 这一步的主要目的是除去核算等低pH等电点物质,其次是浓缩。 上柱结束后,用0.xM的醋酸缓冲液洗涤,然后XXM醋酸缓冲
,才能使用非连续梯度离心。GE Health 公司已有供应不同密度的标志小珠。 ( 4 ) 还原型的细胞色素 C 可以通过用 0.1 mol/L Tris-HCl pH 7.5 稀释氧化型的细胞色素 C,并加入等摩尔量的抗坏血酸来获得。这步反应可以通过测量 400~600 nm 的吸光值来观测。甚至只需用肉眼即可观测到。氧化型的细胞色素 C 呈红棕色,而还原型则呈粉红色。剩余的抗坏血酸在反应结束后必须用脱盐柱子(如 G25 或 PD10 ) 去除。所得的还原状态的细胞色素 C 可以在 -20°C
交换 亲和层析之后,往往使用分子筛做最后的精纯,但如果杂质依然很多或者膜蛋白本身不带标签,则需要使用离子交换层析。 离子交换层析 离子交换层析推荐使用 RESOURCE 和 Capto HiRes 系列,能得到比较好的分辨率。不过要注意阴离子交换实验中不要添加阴离子型去垢剂,阳离子交换实验中则不能加入阳离子型去垢剂,以免影响层析柱载量。 离子交换之前需降低缓冲液中盐浓度,由于膜蛋白的特殊性,推荐使用脱盐柱进行此步骤,根据样品体积可选择 HiTrap Desalting
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