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文献和实验设计应遵循以下两点: 在C-端加入标签 使用长标签或者引入一段linker 由于膜蛋白 N 端信号肽的存在,标签只能加在 C 端。8—10 个组氨酸标签能够提高膜蛋白的结合强度,进而提高收率。 有时可以采取快速的方法进行第一步亲和层析。在细胞破碎阶段,直接加入去垢剂来溶解膜蛋白(不需要提前分离细胞膜),通过此法得到的上清可直接用 HisTrap FF crude 预装柱进行纯化,缩短实验时间。 分子筛 vS 离子交换 亲和层析之后,往往使用分子筛做最后的精纯,但如果杂质依然很多或者膜蛋白
酶切位点。 标签设计应遵循以下两点: 在 C-端加入标签 使用长标签或者引入一段 linker 由于膜蛋白 N 端信号肽的存在,标签只能加在 C 端。8-10 个组氨酸标签能够提高膜蛋白的结合强度,进而提高收率。 有时可以采取快速的方法进行第一步亲和层析。在细胞破碎阶段,直接加入去垢剂来溶解膜蛋白(不需要提前分离细胞膜),通过此法得到的上清可直接用 HisTrap FF crude 预装柱进行纯化,缩短实验时间。 分子筛 vs 离子
荧光蛋白-谷丙转氨酶)使用单一亲和层析和两步亲和层析的对比实验。HisTrap HP 纯化结果显示,填料对其它含有暴露的组氨酸残基的蛋白也具有亲和作用。GST 标签与 GSTrap 4B 上的谷胱甘肽配基特异性较高,可以产生较高纯度的蛋白。两个标签组合纯化可以得到最高纯度的蛋白。 双标签绿色荧光蛋白 结语 相比于单标签的一步亲和层析,双标签两步亲和层析可得到更高纯度蛋白。对于不同蛋白,您可以尝试在目的蛋白同侧或两侧,选择不同标签组合进行构建,以提高目的蛋白特异性甚至改善溶解性。 目前,Cytiva
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