猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸检测试剂盒（探针法荧

【产品名称】
商品名称：猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）
Name    ：Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus Detection Kit （Real-Time PCR Method）
【包装规格】25T/盒、50T/盒
【预期用途】 猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome, PRRS），又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起猪的高度接触性传染病，我国列为二类传染病。该病的主要临床特征为：厌食，发热，母猪    流产、产死胎、产弱胎和木乃伊胎以及各种年龄猪呼吸困难。根据基因型和抗原性的差异，PRRSV 通常被分为欧洲型和美洲型，我国主要流行的是美洲型 PRRSV，但近几年我国多地区也相继分离到欧洲型 PRRSV。 本试剂盒适用于检测肺、扁桃体和口腔拭子、全血等标本中猪繁殖与呼吸综合征病毒 RNA，适用于猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的辅助诊断。
【检验原理】 本试剂盒用一对猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对猪繁殖与呼吸综合征病毒的 RNA 进行体外扩增检测，用于科研实验中对可疑感染病料的病原学检测。

 【试剂组成】

包装规格	50T/盒
PRRSV 反应液	500μL×2 管
酶液	50μL×1 管
PRRSV 阳性质控品	50μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管

说明：不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
【储存条件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】 ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】 病死或扑杀猪，取肺脏、淋巴结、扁桃体、脾脏等组织；待检活猪，取口腔拭子或取血 5mL；公猪可采集精液。 血清样品采集：用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少于 5mL，置于无菌离心管内，2000r/min~3000r/min 离心 10min，吸取上清液到新的离心管内备用。公猪精液：按照 GB/T25172-2020 的方法采集和保存精液。口腔拭子：大猪使用保定器保定，小猪可以双手保定，用采样拭子蘸取口腔分泌物，放入无菌采样管中。肺灌洗液：完    整摘取肺脏/肺叶，送实验室进行灌洗。组织样品：取肺脏、淋巴结、扁桃体、脾脏等组织，置于无菌离心管内备用。
【保存和运输】 采集或处理好的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70℃以下保存，冻融不超过 3 次。

【使用方法】
1.    样品处理（样本处理区）
1.1    样本前处理 血清和精液样品：无需进行前处理，直接用于核酸提取；口腔拭子样品：加入 500μL 无菌 PBS，充分涡旋震荡 1min，反复挤压拭子，弃去拭子后 3000r/min 离心 5min，取上清用于后续的核酸提取。肺灌洗液：根据肺脏/肺叶的大小，通过肺管加入 5mL~10mL 无菌 PBS，反复揉捏，吸取灌洗液，3000r/min 离心 5 min，取上清用于核酸提取。组织样品：取 1g 组织，剪碎，加人 2mL 生理盐水进行研磨，制备组织匀浆，8000r/min 离心 5min， 取上清用于后续的核酸提取。
1.2    核酸提取 推荐采用上海烜雅生物科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请   按照试剂说明书进行操作。
2.    试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表：

试剂	PRRSV 反应液	酶液
用量	19μL	1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3.    加样（样本处理区） 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4.    PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1    将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；
4.2    设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择：检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光，选择 None 即可。
4.3    推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	1 cycle	50℃	10min	否
2	1 cycle	95℃	2min	否
3	45 cycle	95℃	15sec	否
		60℃	30sec	是

5.    结果分析判定
5.1    结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例） 反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2    结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3    质控标准 阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示； 阳性质控品：扩增曲线有明显指数增长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6.    检测方法的局限性
1.    样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2.    样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3.    阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4.    病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5.    不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6.    试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7.    本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1.    所有操作严格按照说明书进行；
2.    试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.    反应液应避光保存；
4.    反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.    使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.    样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.    实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.    试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）相关产品：

Radix angelicae dahuricae白芷染料法PCR鉴定试剂盒

Cortex dictamni白鲜皮染料法PCR鉴定试剂盒

Radix cynanchi atrati白薇染料法PCR鉴定试剂盒

Radix pulsatillae白头翁染料法PCR鉴定试剂盒

Radix paeoniae alba白芍染料法PCR鉴定试剂盒

Rhizoma cynanchi stauntonii白前染料法PCR鉴定试剂盒

Rhizoma imperatae白茅根染料法PCR鉴定试剂盒

Radix ampelopsis白蔹染料法PCR鉴定试剂盒

Rhizoma bletillae白及染料法PCR鉴定试剂盒

Bulbus lilii百合染料法PCR鉴定试剂盒

Semen ginkgo白果染料法PCR鉴定试剂盒

Rhizoma typhonii白附子染料法PCR鉴定试剂盒

Radix stemonae百部染料法PCR鉴定试剂盒

Semen lablab album白扁豆染料法PCR鉴定试剂盒

Radix morindae officinalis巴戟天染料法PCR鉴定试剂盒

Folium artemisiae argyi艾叶染料法PCR鉴定试剂盒

貂源性成分染料法荧光定量PCR试剂盒

人类白细胞抗原A（HLA-A）基因染料法荧光定量PCR试剂盒

Koi Herpesvirus(KHV)锦鲤疱疹病毒Sph基因染料法荧光定量PCR试剂盒

Koi Herpesvirus(KHV)锦鲤疱疹病毒TK基因染料法荧光定量PCR试剂盒