猪瘟病毒（CSFV）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）

【产品名称】
商品名称：猪瘟病毒（CSFV）核酸检测试剂盒（探针法荧光PCR）
Name    ：Classical Swine Fever Virus Detection Kit （Real-Time PCR Method）
【包装规格】50T/盒
【预期用途】 猪瘟是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起猪的以稽留高热、皮肤和黏膜出现大量出血点为主要特征的一种高度接触性、致死性的传染病。 本试剂盒适用于检测的内脏器官、抗凝血等标本中猪瘟病毒 RNA，适用于猪瘟病毒感染的辅助诊断。
【检验原理】 本试剂盒用一对猪瘟病毒特异性引物，结合一条特异性荧光探针，用一步法荧光 RT-PCR 技术对猪瘟病毒 RNA 进行体外扩增检测，用于科研实验中对可疑感染病料的病原学检测。

 【试剂组成】

包装规格	50T/盒
CSFV 反应液	500μL×2 管
酶液	50μL×1 管
CSFV 阳性质控品	50μL ×1 管
阴性质控品	250μL ×1 管

注：不同批号试剂不能混用。
【储存条件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、运输、反复冻融次数不超过 5 次，有效期 12 个月。
【适用仪器】 ABI7500、安捷伦 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列荧光定量 PCR 检测仪。
【标本采集】 内脏样品：采取病死猪各种脏器(淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏)装入一次性塑料袋或其他灭菌容   器，编号，送实验室：4%EDTA 抗凝血：用无菌注射器直接全血，注入含 1/10 4%EDTA 溶液的无菌容器中，充分混匀后编号备用。 其它样本采集请参考 GB/T 27540-2011 《猪瘟病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法》 【保存和运输】 采集或处理的样品在 2℃~8℃条件下保存应不超过 24h；若需长期保存,应放置-70℃冰箱,但应避免反复冻融(冻融不超过 3 次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在 6h~8h 之内运送到实验室。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识。

【使用方法】
1.    样品处理（样本处理区）
1.1    样本前处理 内脏样品：取 50mg~100mg 待检样品，按 1:5 倍体积加入 DEPC 水，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，3000g 离心 15 min，取上清液转入离心管中编号备用。 其它样本前处理请参考 GB/T 27540-2011  《猪瘟病毒实时荧光RT-PCR 检测方法》
1.2    核酸提取 推荐采用上海烜雅生物科技有限公司生产的核酸提取或纯化试剂（磁珠法或离心柱法）进行核酸提取，请    按照试剂说明书进行操作。
2.    试剂配制（试剂准备区） 根据待检测样本总数，设所需要的 PCR 反应管管数为 N（N=样本数+1 管阴性对照+1 管阳性对照；反应管数每满 10 份，多配制 1 份），每测试反应体系配制如下表： 

试剂	CSFV 反应液	酶液
用量	19μL	1μL

将混合好的测试反应液分装到 PCR 反应管中，20μL/管。
3.    加样（样本处理区） 将步骤 1 提取的核酸、阳性质控品、阴性质控品各取 5μL，分别加入相应的反应管中，盖好管盖，混匀，短暂离心。
4.    PCR 扩增（核酸扩增区）
4.1    将待检测反应管置于荧光定量 PCR 仪反应槽内；  
4.2    设置好通道、样品信息，反应体系设置为 25μL；荧光通道选择： 检测通道（Reporter Dye）FAM， 淬灭通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列仪器请勿选择 ROX 参比荧光， 选择 None 即可。
4.3    推荐循环参数设置：

步骤	循环数	温度	时间	收集荧光信号
1	1 cycle	50℃	10min	否
2	1 cycle	95℃	2min	否
3	45 cycle	95℃	15sec	否
		60℃	30sec	是

5.    结果分析判定
5.1    结果分析条件设定（请参照各仪器使用说明书进行设置，以分析 ABI7500 仪器为例） 反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用户可根据实际情况自行调整，Start 值可设在 3～15、End 值可设在 5～20，使阈值线位于扩增曲线指数期，阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击 Analyze 自动获得分析结果。
5.2    结果判断 阳性：检测通道 Ct 值≤40，且曲线有明显的指数增长曲线； 阴性：样本检测结果 Ct 值>40 或无 Ct 值。
5.3    质控标准 阴性质控品：无特异性扩增曲线或无 Ct 值显示； 阳性质控品：扩增曲线有明显指数生长期，且 Ct 值≤32； 以上条件应同时满足，否则实验视为无效。
6.    检测方法的局限性
1.    样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；
2.    样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；
3.    阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；
4.    病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；
5.    不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；
6.    试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；
7.    本检测结果仅供参考，如须确诊请结合临床症状以及其他检测手段。
【注意事项】
1.    所有操作严格按照说明书进行；
2.    试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；
3.    反应液应避光保存；
4.    反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；
5.    使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；
6.    样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；
7.    实验完毕后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；
8.    试剂盒里所有物品应视为污染物对待，并按照《微生物生物医学实验室生物安全通则》进行处理。

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