小鼠卵巢类器官

小鼠卵巢类器官的培养在操作难度和技术门槛方面具有一定的挑战性，但通过标准化的流程和详细的指导，可以有效降低技术难度，提高成功率。以下是小鼠卵巢类器官培养的关键步骤和注意事项： 操作难度及技术门槛 环境无菌要求： 所有涉及的耗材，包括离心管、枪头等，必须使用无菌无酶包装的产品。自行采用高温蒸汽灭菌的方式是不可取的，因为难以确保完全排除引入二次污染的可能性，从而可能对类器官培养的无菌环境造成破坏，影响培养结果的准确性与可靠性。 仪器设备： 需要准备CO2培养箱（支持干热灭菌型号）、双人单面超净台、倒置荧光显微镜、台式冷冻离心机、水浴锅或水浴摇床、医用冰箱、-80℃冰箱、移液器（一套）、眼科剪和眼科镊若干。 耗材需求： 需要60mm细胞培养皿、100μm细胞滤筛、15ml离心管、1.5ml EP管（无菌无酶）、24孔细胞培养板、金属冰盒和0.22μm细胞滤器等若干。 液体无菌要求： 凡接触类器官培养的液体，除能明确无菌无污染的情况外，均需通过0.22μm细胞滤器进行过滤除菌，以防意外污染。 操作人员要求： 开展类器官分离培养工作的人员，应具备基本的细胞培养经验，熟知无菌操作规范，并仔细阅读实验方案。 培养步骤 原代培养： 取材后的小鼠正常卵巢组织须在2-8℃清洗，准备若干培养皿，加入4℃预冷的原代培养缓冲液B备用（添加双抗和庆大霉素）。将组织放入培养皿中，利用原代培养缓冲液B清洗三次后，利用眼科剪或手术刀将组织剪切成体积约为1-3mm³的组织块。 组织用小鼠正常卵巢原代组织消化液C消化，37℃震荡消化15-20分钟，消化过程中随时观察消化情况。取少量液体在显微镜下观察，镜下观察到较多的单个细胞或70μm以下的细胞簇后，加入三倍体积原代培养缓冲液B终止消化。 使用100μm孔径的筛网进行过滤，将滤液收集后，于300g富集离心5分钟，移去上清，添加原代培养缓冲液B重新重悬离心。 基质胶计算：第6步后观察收集到的组织体积，添加25-30倍组织体积的基质胶（abs9495）重悬铺板。24孔细胞培养板为例，每孔点胶25μL组织基质胶混合物进行铺板（4℃下操作）。 将铺好的培养板放入37℃培养箱中10-15分钟成胶，添加小鼠正常卵巢类器官培养基A（恢复室温）进行培养。 类器官传代培养： 移液器吸去培养基，每孔添加1-2mL 4℃类器官传代培养缓冲液G放置2分钟。移液枪轻柔吹打基质胶，收集在15ml离心管中，4℃静置10分钟（每6-8孔为一组）。 类器官数量不足或体积较小时：离心5分钟弃去上清，添加适量类器官传代培养缓冲液G重悬移入1.5ml离心管，300g离心5分钟弃去液体进行第4步。 类器官数量较多或体积较大时：离心5分钟弃去上清，添加适量类器官传代消化液D消化2-3分钟，添加类器官传代培养缓冲液G终止消化，离心5分钟弃去混合液，添加适量类器官传代培养缓冲液G重悬移入1.5ml离心管，300g离心5分钟弃去液体进行第4步。 类器官收集后，添加基质胶重悬，每孔25μL基质胶铺在24孔细胞培养板中，放置培养箱中10-15分钟添加500μL小鼠正常卵巢类器官培养基A。 总结 小鼠卵巢类器官的培养虽然在操作难度和技术门槛方面有一定要求，但通过标准化的流程和详细的指导，可以有效降低技术难度，提高成功率。这些步骤和注意事项确保了培养过程的无菌性和操作的准确性，为研究人员提供了一个可靠的研究平台。