血管内皮细胞的分离与培养

血管内皮细胞的分离与培养：

血管内皮细胞裱衬在整个心血管系统的内表面，为单层扁平上皮，是血管壁与血液之间的分界细胞，是形成心血管封闭管道系统的形态基础。目前认为血管壁内皮细胞具有分泌、合成功能，与凝血系统、纤溶系统和补体系统有关。大血管（脐静脉、大动脉等）内皮细胞的分离培养主要采用消化酶灌注法，而微血管（如皮肤、脑和脊髓等）内皮细胞分离培养比较困难，具有特殊性。血管内皮细胞是体外研究血管功能、组织修复、再生医学、衰老和肿瘤转移的重要工具。

 

1. 酶消化法

这是一种常用的方法，通过使用酶类（如胰蛋白酶或胶原蛋白酶）来分解血管壁的基质，释放出内皮细胞。具体步骤如下：

1. 将心脏放入含有HBSS/PS的Petri培养皿中，去除与心脏相连的血管。
2. 将心脏切成两半，取出较大的血块和结缔组织。
3. 将心脏放入含有CMF（不含Ca2+和Mg2+的HBSS）的Petri培养皿中，冲洗后换入新鲜CMF。
4. 用手术刀将组织切成小块，用CMF洗组织块。
5. 将组织块悬起，再让其沉下，由此用CMF洗组织块。
6. 用手术刀片取组织块，然后移入含有温胶原酶A的容器中。
7. 在37°C条件下孵育30分钟，同时搅动组织块。
8. 加入CMF，摇动组织块，然后让其沉下，由此分散细胞。
9. 将细胞悬液移入试管，重复步骤8和步骤9几次。
10. 将细胞悬液离心（300 g，8 min）。
11. 轻轻吸去上清液，避免搅动细胞。
12. 用胰蛋白酶和EDTA混合液将细胞混悬，通过用吸管吹打将成团的细胞分散，然后在37°C条件下孵育10分钟。
13. 将含1% FBS的HBSS/FB加入已消化的组织和细胞，用孔径为70 μm的细胞滤器过滤。

2. 机械刮脱法

这种方法适用于大血管内皮细胞的分离，避免了酶对内皮细胞的损伤和其他细胞的污染。具体步骤如下：

1. 取长度为20cm的大血管，用D-Hanks液将血管内、外冲洗干净后，无菌条件下沿纵轴剪开，使血管内皮朝上向外暴露。
2. 用D-Hanks液冲洗2次，然后用刮刀轻轻刮取内膜表面的内皮细胞。
3. 刮取时，动作应轻柔均匀，刮刀与表面的角度约为60℃，每处只能刮1次，不可刮血管的边缘。
4. 刮下的细胞悬浮于M199液中，以1000r/min离心7～10min，去上清，再重复洗涤1次，重新悬浮于20%小牛血清M199培养液中备用。

3. 磁珠分离法

这种方法利用免疫磁珠分离内皮细胞，适用于从已分散的心脏组织中分离内皮细胞。具体步骤如下：

1. 将适当体积的Dynabeads加入制备的单细胞悬液中。
2. 在2-8°C下孵育20分钟（阳性分离）或30分钟（去除），同时轻轻倾斜和旋转试管。
3. 将试管放入磁铁2分钟。
4. 如需去除，将上清液转移至新试管中，待进一步使用。
5. 如需阳性分离，丢弃上清液并洗涤微珠结合细胞3次，然后使用磁铁进行分离。现在，微珠结合内皮细胞可用于铺板或进一步分析。

案例展示：

公司简介：

     上海申知心生物科技有限公司是一家“提供全面、系统、高质量的心血管相关疾病研究服务平台"的创新型企业，致力于搭建基础医学和临床转化服务体系并开展基于药效学评价的临床前CRO服务，提供各种成熟的心血管疾病模式动物。公司投资建立的动物实验中心，建有清洁级、SPF级动物实验室，。为科研院所、临床科室及医药企业提供专业定制化的动物模型、药物筛选、药理药效评价、安全性评价、病理分析及分子生物学检测等服务。

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