博来霉素

Zeocin即phleomycin D1，中文名称博来霉素或者腐草霉素D1，是从轮状链霉菌(Streptomyces verticillus)的一个突变体菌株中分离而来的博来霉素/腐草霉素(bleomycin/phleomycin)的抗生素家族成员。它对细菌、真菌(包括酵母)、植物和哺乳动物细胞均有抑制作用和细胞毒性。

Zeocin是一种碱性、水溶性的、铜离子螯合的糖肽抗生素。Cu²⁺螯合的Zeocin溶液呈现蓝色，无活性。当其进入细胞后，Zeocin上的Cu²⁺被还原为一价铜离子(Cu⁺)，并被细胞内的巯基化合物(sulfhydryl compound)清除，导致Zeocin被活化，能够结合到细胞内DNA上并使其断裂，最终导致细胞死亡。

对Zeocin产生抗性的蛋白是来源于印度链球菌(Streptoalloteichus hindustanus)的Sh ble基因编码一种14kDa大小的蛋白，它能够以一定比率结合Zeocin，使其不能结合细胞DNA，抑制其DNA断裂活性，从而使细胞对Zeocin产生抗性。因此，Zeocin可用来筛选表达Zeocin抗性基因的多克隆或单克隆细胞，或用于相应的多克隆或单克隆细胞的维持性培养。

Zeocin对于绝大多数好氧细胞均有效，常用于细菌(如大肠杆菌)、真核微生物(如酵母)及动植物细胞的筛选。大肠杆菌筛选推荐浓度为25~50μg/ml (低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L)；酵母筛选推荐浓度为50~300ug/ml (YPD或基本培养基)；哺乳动物细胞筛选推荐浓度为50~1000ug/ml (合适培养基，根据细胞系的类型而不同)。实际应用时，应针对不同的细胞系测试Zeocin的浓度梯度，以确定最佳使用浓度。

化学性质：

化学名	(7R)-N1-[4-[[Amino(imino)methyl]amino]butyl]-7,8-dihydrobleomycinamide
化学式	C55H85O21N20S2Cu
CAS号	11006-33-0
纯度	BioReagent,≥80%
分子量	1474.03
溶解性	H2O: 50 mg/mL

本产品溶液包装配制在去离子水中，浓度为20mg/ml，经0.22μm滤膜过滤除菌，可以直接用于细胞培养。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
ST1450-20mg	Zeocin (博莱霉素)	20mg
ST1450-100mg	Zeocin (博莱霉素)	100mg
ST1450-0.25ml	Zeocin (博莱霉素)	20mg/ml×0.25ml
ST1450-1ml	Zeocin (博莱霉素)	20mg/ml×1ml
－	说明书	1份

保存条件：

-20℃避光保存，至少一年有效。20mg/ml溶液包装适当避免反复冻融。

注意事项：

Zeocin人体有害，操作时请小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

Zeocin对光敏感，需避光保存于-20℃。含有该抗生素的平板或培养基也需避光保存。

高离子强度、酸或碱性都会抑制Zeocin的活性，该抗生素在过高或过低pH及弱氧化剂的条件下不稳定，且变性不可逆。在培养细菌时，需适当降低细菌培养基的盐浓度(低盐LB培养基，NaCl浓度不能超过5g/L)并调整pH至7.5，从而使其保持活性。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：
1.细菌的筛选(以大肠杆菌为例)。
a.使用不含Tn5转座子元件的宿主细胞如Top10、DH5和DH10等进行筛选
b.需使用低盐LB培养基(10g胰蛋白胨，5g NaCl，5g酵母提取物，调整pH至7.5，加水定容至1L)以维持Zeocin的活性。
c.Zeocin筛选的推荐浓度为25~50μg/ml。
2.真菌的筛选(以酵母为例)。
a.适用于酿酒酵母和毕赤酵母。
b.培养基的选择：含1M山梨醇的YPD培养基(适用于电穿孔法转染细胞)；YPD或基本培养基(适用于化学法转染细胞)。调整培养基pH至6.5~8.0，并选择使用最低有效浓度的Zeocin进行筛选。
c.转染方法：需使用电穿孔或锂离子转染法。不要使用酵母原生质球(spheroplasting)进行Zeocin抗性的转染及筛选，因为Zeocin会导致原生质球的完全死亡。
d.Zeocin筛选的推荐浓度为50~300μg/ml。具体浓度与酵母菌株、培养基pH以及离子强度有关。
3.哺乳动物稳定表达细胞株的筛选。
Zeocin用于哺乳动物细胞筛选常用浓度为50-1000μg/ml (平均常用浓度为250-400μg/ml)。影响筛选浓度的主要因素包括离子强度、细胞类型、细胞生长密度以及生长速率。根据细胞类型的不同，需要1-2周可以筛选到Zeocin抗性的细胞。在筛选稳定表达细胞株之前，需要先确定能够杀死未转染细胞的Zeocin最佳工作浓度。Zeocin的最佳工作浓度需要通过剂量效应曲线来确定。下表中列出了部分细胞中Zeocin的筛选浓度范围以供参考。
表1.部分常见哺乳动物细胞的Zeocin推荐筛选浓度表

Cell Type	Culture Medium	Zeocin Concentration
B16 (Mouse melanocytes)	RPMI	20-250μg/ml
CHO (Chinese hamster ovarian cells)	DMEM	100-500μg/ml
COS (Monkey kidney cells)	DMEM	100-400μg/ml
HEK293 (Human embryonic kidney cells)	DMEM	100-400μg/ml
HeLa (Human uterine cells)	DMEM	50-100μg/ml
J558L (Mouse melanocytes)	RPMI	400μg/ml
MCF-7 (Human breast adenocarcinoma cells)	DMEM	100-400μg/ml
MEFs (Mouse embryonic fibroblasts)	DMEM	200-400μg/ml
THP-1 (Human monocytes)	RMPI	200μg/ml

a.细胞对Zeocin敏感性的确定(杀灭曲线的建立)。
(a)接种细胞使得细胞密度约为25%，按照8、16或24个细胞培养孔(分别为单个培养孔、复孔和三复孔)准备培养的细胞，培养24h。
(b)去除细胞培养液，换成含不同浓度Zeocin的新鲜筛选培养液(0, 50, 100, 200, 400, 600, 800和1000μg/ml)。
(c)每2-4天更换新鲜的筛选培养液，观察存活细胞的比例，选择在1-2周内杀死所有细胞的最低浓度作为最佳工作浓度。
b.筛选Zeocin抗性的稳定细胞株。
(a)按照20%-30%的细胞密度接种细胞，培养过夜。
(b)转染携带Zeocin抗性基因的质粒或感染携带Zeocin抗性基因的病毒，同时设置没有转染质粒或感染病毒的细胞作为对照。说明：没有转染质粒或感染病毒的细胞，也需要同样进行转染质粒或感染病毒的相应实验操作。
(c)转染或感染48-72h后，换成含有最佳工作浓度的Zeocin (由步骤a中的杀灭曲线确定)的新鲜培养液，继续培养。如果有必要，可以对细胞进行传代，略稀释后进行筛选培养。
(d)每2-4天更换含有Zeocin的新鲜筛选培养液。
(e)对照组正常细胞100%死亡，Zeocin抗性组中存活的细胞即为表达Zeocin抗性基因的细胞。然后根据实验目的进行多克隆或单克隆细胞的筛选。根据细胞种类和转染/筛选效率，单克隆细胞株的形成可能需要一周或更多的时间。
注意：若待筛选细胞对Zeocin的抗性明显强于大部分细胞，则按照以下方法克服此类耐受性：用含Zeocin培养液进行细胞接种培养，置于37℃孵育2-3h，使得细胞贴壁。然后将细胞置于4℃，2h。需要使用HEPES作为培养基的缓冲体系。重新将细胞置于37℃孵育。4℃孵育细胞的目的是短时间内终止细胞分化，使得Zeocin能发挥作用，杀死细胞。
c.稳定细胞株的维持培养
可采取如下几种方式之一来维持培养稳定细胞株。
(a)使用含有与上述筛选稳定转染细胞株相同浓度的Zeocin筛选培养液来维持培养。
(b)降低Zeocin浓度为筛选浓度的一半进行维持培养。
(c)使用刚好能预防敏感细胞生长但不足以致死的Zeocin浓度来维持培养(根据杀灭曲线来判断)。

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