DYKDDDDK-Nanoab-Agarose beads（

产品货号：FA0050

储存条件：2℃-8℃短期保存；于-20℃长期保存

 

1.产品介绍

Flag 标签是一个由八个亲水氨基酸组成的多肽片段，定位在融合蛋白表面，因此更易与抗体结合以及被肠激酶分解。DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads是以抗Flag(DYKDDDDK)纳米抗体为亲和配体，一步纯化原核、酵母或哺乳动物细胞表达的Flag 标签融合蛋白。

DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads以4%琼脂糖凝胶为基质，杂蛋白非特异性结合少，可用于Flag标签融合蛋白的纯化和免疫沉淀（IP)。

 

2.试剂准备

2.1样品准备

上柱之前要确保样品溶液有合适的离子强度和pH值，可以用平衡液对样品或细胞培养液稀释，或者用平衡液透析。样品在上样前建议离心或用0.22 um或0.45 um滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子。

2.2缓冲液的准备

所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22 um 或0.45 um滤膜过滤。

平衡/洗杂液： 50 mM Tris，0.15 M NaCl，pH7.4

酸性洗脱液：0.1 M glycine HCl，pH3.0

竞争性洗脱液：50 mM Tris，0.15 M NaCl，100-500 ug flag多肽/ml，pH7.4

中和液：1 M Tris-HCl，pH8.0

 

3.样品纯化

3.1柱层析

1) 将DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads装入合适的层析柱，层析用5倍柱体积的平衡液进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下。

2) 将样品加到平衡好的DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads中，收集流出液，可以反复上样增加结合效率。

3) 用10倍柱体积的洗杂液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。

4) A酸性洗脱∶使用5倍柱体积的酸性洗脱液洗脱，收集管中预先加好中和液，加入量15-25 ul中和液/ml洗脱液，分管收集。

注：酸性洗脱后填料要立即用平衡液平衡，DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads在洗脱液中不要超过20 min。

B竞争性洗脱：使用5倍柱体积的竞争性洗脱液洗脱。分管收集。

5) 使用3倍柱体积的洗脱液再生，然后用平衡液平衡至中性。

6) 然后保存在含20%乙醇的PBS溶液中，2-8℃保存。

3.2静态吸附

1）填料准备∶取适量DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads加入层析柱中，流干保护液。加入5倍柱体积的平衡液清洗。 

2) 加入样品溶液，4℃或室温震荡孵育至少30 min(不能磁力搅拌)，确保填料与样品溶液充分混合。

3) 孵育完毕后，将填料混合液离心(5000×g 离心1 min)或过滤收集填料。

4) 将填料装入层析柱中，用平衡液清洗直至紫外稳定。

5) 用酸性洗脱液或竞争性洗脱液洗脱，参考3.1中4)。

6) 填料再生和保存参考3.1中5)和6)。

3.3免疫沉淀操作流程

1) 填料准备：取40ul的DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads (柱体积20 pl)混合液加入到2ml离心管中，5000xg离心1 min，吸弃上清。

2) 填料加入0.5 ml平衡液，悬浮填料（使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用)，5000×g离心1 min，吸弃上清。重复一次。

3) 加入200-100 uI样品裂解液到处理好的填料中，混合均匀，在室温下置于翻转混合仪轻轻翻转离心管，促使样品和填料充分接触并吸附，室温至少1 h。5000xg 离心 1 min，吸弃上清。

4) 洗杂：加入0.5 ml的洗杂液，悬浮填料，轻轻混匀，5000xg离心1 min，吸弃上清。再重复三次。确保去除非特异性吸附。

5) 样品洗脱：可根据后期检测的需要选择不同的洗脱方法。

A：酸性洗脱

加入100ul酸性洗脱液，悬浮填料。室温孵育5 min,5000xg离心1 min。小心取出上清,不要吸到填料，用中和液中和。洗脱样品放置4℃,长时间放置-20℃保存。

B：竞争性洗脱

加入100ul竞争性洗脱液洗脱。室温孵育30 min, 5000×g离心1 min。 小心取出上清，不要吸到填料。洗脱样品放置4℃，长时间放置-20℃保存。

C：变性洗脱

含有SDS的样品缓冲液可以使DYKDDDDK抗体变性，洗脱后的DYKDDDDK-Nanoab-agarose Beads没办法重复使用。

每管中加入20 ul 2× Loading Buffer，95℃加热 5min。5000xg离心1 min，吸取上清SDS-PAGE电泳检测。