碱性磷酸酶检测试剂盒(荧光法)

碧云天研发的碱性磷酸酶检测试剂盒(荧光法)，即Alkaline Phosphatase Assay Kit (Fluorometric)，简称ALP检测试剂盒或AP检测试剂盒，是一种使用荧光法快速、高灵敏地检测血清或血浆等生物体液、细胞培养上清以及细胞或组织裂解液等样品中碱性磷酸酶活性的试剂盒。通常0.1-1μl血清或血浆样品足够用于本试剂盒的检测。

碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AP/ALP/AKP/ALKP/ALPase/Alk Phos)，也称碱性磷酸酯酶(EC 3.1.3.1)，可以在碱性条件下催化磷酸酯键的水解。大部分碱性磷酸酶以同源二聚体形式存在，每个催化位点含有酶活性所需的三个金属离子，即两个锌和一个镁[1]。碱性磷酸酶参与机体代谢、信号转导、分子运输和遗传信息的表达等生物学过程，其生理功能对生物体至关重要[2]。哺乳动物中，肝脏、胆管、肾脏、骨头和胎盘中的碱性磷酸酶活性比较高。常见的碱性磷酸酶包括肠道碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, intestinal, ALPI)、非组织特异性碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, tissue-nonspecific isozyme, ALPL)和胎盘碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase, placental type, 也称Placental alkaline phosphatase, PLAP)。常见的小牛肠碱性磷酸酶(Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, CIAP/CIP)被广泛用于二抗等的标记最终用于蛋白和核酸等的检测，也常用于DNA或RNA 5'和3'末端的去磷酸化(去单磷酸化)，特别是质粒的5'末端去磷酸化以避免质粒自连等。

在实验室医学中，ALP是一系列疾病的公认生物标志物。干细胞，如iPS中，碱性磷酸酶的活性很高，常被用作iPS成功诱导的标志。另外，分化的结肠癌细胞中碱性磷酸酶的活性也会显著升高，可作为结肠癌细胞分化程度定性和定量的指标。此外，血清中碱性磷酸酯酶的升高，被称作高碱性磷酸酶血症(Hyper alkaline phosphatasemia)，被认为和恶性胆管阻塞(Malignant biliary obstruction)、原发性胆管硬化(Primary biliary cirrhosis)、原发性硬化胆管炎(Primary sclerosing cholangitis)、肝淋巴瘤(Hepatic lymphoma)和肝肉瘤(Hepatic sarcoidosis)等肝胆疾病密切相关。血清中碱性磷酸酶活性升高还和骨头生成密切相关，因为碱性磷酸酶是成骨细胞的副产物。血清中碱性磷酸酶活性过低也和一些疾病相关，儿童和孕妇血清中的碱性磷酸酶活性较普通人高一些。血清中碱性磷酸酶活性范围在20-140U/L。

本试剂盒检测碱性磷酸酶的原理如图1所示。在碱性条件下，4-甲基伞形酮磷酸酯二钠盐(4-Methylumbelliferyl phosphate disodium salt, 4-MUP)在碱性磷酸酶的作用下，被水解为4-甲基伞形酮(4-Methylumbelliferone, 4-MU)和磷酸盐(Phosphate)。生成的4-MU呈蓝色荧光，激发波长为360nm，发射波长为450nm。碱性磷酸酶的荧光强度与其催化产生的4-MU的量成正比，通过检测4-MU的荧光强度最终计算出碱性磷酸酶的活性。

图1.碧云天碱性磷酸酶检测试剂盒(荧光法) (P0322)检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。相较于碱性磷酸酶检测试剂盒(P0321)，本试剂盒的检测灵敏度更高、检测方法更加灵活。本试剂盒在样品体积为20μl时可检测活力低至0.008U/L的碱性磷酸酶，在0.008-32U/L活力范围内有良好的线性关系。本试剂盒提供了碱性磷酸酶反应产物4-MU的标准溶液，可以通过绘制标准曲线(图2A)，计算出样品中碱性磷酸酶的活性。

图2.碧云天碱性磷酸酶检测试剂盒(荧光法) (P0322)对4-MU标准品、阳性对照、HeLa细胞和小鼠不同组织样品检测效果图。图2A为本试剂盒对4-MU标准品的检测效果图，在0.005-20nmol范围内有良好的线性关系；图2B为本试剂盒检测阳性对照(Positive control)、2μg蛋白量的HeLa细胞裂解液样品(HeLa Cell)、60μg蛋白量的小鼠肝脏裂解样品(Mouse liver)、25μg蛋白量的小鼠腿肌裂解样品(Mouse muscle)时反应30分钟内的荧光信号变化图。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒提供的检测裂解液有一定的通用性。使用本试剂盒中的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay裂解获得的细胞或组织样品，也可以用于碧云天生产的其它代谢类试剂盒中同样使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay进行裂解的样品检测，通用性强；而且还可用于检测蛋白浓度、进行SDS-PAGE或一些较易溶解蛋白的Western检测。

本试剂盒检测使用灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆、尿液等生物体液、细胞培养上清以及组织或细胞裂解液等样品的检测。整个检测过程约1小时即可完成。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

按照使用操作说明，用于96孔板进行检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测，中包装可以进行500次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
P0322S-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	20ml
P0322S-2	ALP Assay Buffer	15ml
P0322S-3	MUP Substrate (100X)	100μl
P0322S-4	Positive Control (100X)	20μl
P0322S-5	4-MU (50mM)	50μl
—	说明书	1份

 

产品编号	产品名称	包装
P0322M-1	BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay	100ml
P0322M-2	ALP Assay Buffer	75ml
P0322M-3	MUP Substrate (100X)	500μl
P0322M-4	Positive Control (100X)	100μl
P0322M-5	4-MU (50mM)	250μl
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC保存，一年有效。其中4-MU须避光保存。所有试剂避免反复冻融。

注意事项：

BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、ALP Assay Buffer、MUP Substrate (100X)、4-MU (50mM)需要完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。其它试剂使用时应在冰上进行。

血清等样品如在4ºC保存，保存时间不得超过2周，否则会影响检测结果的准确性。通常血清样品宜在-20ºC保存，-80ºC保存更佳。

样品溶液中须避免含有EDTA、氟离子、酒石酸盐、草酸盐、柠檬酸盐等碱性磷酸酶的抑制剂。

检测时建议使用96孔黑板，推荐选购碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(平底带盖, 独立包装) (FCP966)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。