lncRNA qPCR 引物定制

lncRNA的序列查找，引物设计和实验方案推荐

BioTNT 的lncRNA引物设计验证服务

一、序列查找：
ncbi 查找lncRNA序列；
ensemble 查找lncRNA 序列；

二、序列比对：
把查找到lncRNA 序列在ncbi blast 里面进行序列比对；
要求：设计的区段必须是特异的区段；
由于ensemble 数据库与ncbi 数据库的不统一，会出现很多难以确认的序列，需要与客户进行沟通确认；
不能确认的序列就不能设计了；
找不到特异的大约200bp 左右的序列片段，原则上也不能进行设计；比较短的特异性序列，建议客户可以更改探针法进行设计；

三、引物设计的原则：
找到特异性序列，就要进行设计了；设计好的序列再进行RNA 序列和基因组序列的比对；
由于lncRNA 通常表达量很少，所以为了排除引物的原因，我们推荐在同一个外显子内进行设计，这样设计出来的引物可以用基因组样本进行验证；
引物设计还应该符合qPCR 的其他原则，如引物长度，产物长度，TM 值，退火温度；引物二级结构良好等特点，在oligo软件中进行引物结构分析；

四、引物特异性比对：
请选用同种属的基因组序列和RNA 序列对引物进行特异性比对；良好的引物应该符合特异性要求；

五、设计的原则
引物合成验证：引物采用Page 纯化，合成后引物应该进行qPCR 实验验证，模板采用基因组DNA 的模板进行验证，得到的产物扩增曲线S 型，熔解曲线单峰，且TM 与引物设计的TM 值相差不超过2度；

六、提供产品：提供两支引物，上下游，浓度为10um，体积为200ul，采用标准的qPCR 两步退火方式；可以进行500T的检测；

客户需要准备的：

（一）样本是否需要去除基因组：由于lncRNA的序列我们采用了同一个外显子的设计方式，所以扩增产物可以在基因组上找到，所以如果想要得到准确的表达结果，样本中应该进行基因组的去除处理，可以在抽提的时候进行基因组去除，也可以在逆转录的时候进行基因组去除；您也可以同时抽提一些含基因组的样本，用于引物的验证；

（二）RNA抽提方法：尽量采用抽提总RNA 方法进行抽提；

（三）逆转录方式：当然，如果要检测lncRNA，由于序列不存在poly A 尾，所以在抽提了RNA, 进行逆转录时，请选择用随机引物逆转录，或者用特异性引物进行逆转录；
所以，抽提的RNA，用mRNA 的oligodT+随机引物的逆转录方式，也是可以检测lncRNA 的；

（四）内参选择：根据抽提的方式和样本的情况，如果是抽提总RNA的，可以用GAPDH，actb作为内参