快速内切酶 AgeI

AgeI 限制性内切酶

产品货号：F3501S

储存条件：-20℃

 

同裂酶：AsiGI, CspAI, BshTI, PinAI；（注：同裂酶对于不同的甲基化修饰可能具有不同敏感性。）

产品组成

组分	规格
LabFD™ AgeI	25ul
10×LabFD™ Buffer	1ml
10×LabFD™ Color Buffer	1ml

产品简介

LabFD™ 快速内切酶是一系列经过基因工程重组的快速限制性内切酶，适用于质粒 DNA、PCR 产物或基因组 DNA 等的快速酶切。

所有 LabFD™ 快速内切酶在通用的LabFD™或LabFD™ Color Buffer中都具有优良的活性，能够在 5~15 分钟内完成酶切。此外，兰博利德去磷酸化、连接试剂在LabFD™ Buffer 中均具有 100% 活性，支持一管化反应，提升“酶切-修饰-连接”的体验。LabFD™ Color Buffer 包括红色和黄色示踪染料，可将产物直接用于凝胶电泳。LabFD™ Color Buffer 的红色染料与 2500 bp 双链DNA 片段在 1% 琼脂糖凝胶中迁移速率接近；黄色染料与 10 bp双链 DNA 片段在 1% 琼脂糖凝胶中迁移速率接近。

 

建议反应条件

1×LabFD™缓冲液；37℃温育；参照“DNA 快速酶切流程”配制反应体系。

失活条件

80℃温育 20 min。

质量控制

功能活性检测

37℃下，在 20ul LabFD™反应体系中，1ul LabFD™ AgeI 能够在 15min 内完全消化 1ug λDNA。

超长时间温育检测

37℃下，将 1ul LabFD™ AgeI 与 1ug λDNA共同温育 3h，未检测到其他核酸酶污染或星号活性引起的底物非特异性降解。更长酶切可能出现星号活性。

酶切-连接-再酶切检测

37℃下，使用 10 倍酶量的 LabFD™ AgeI 消化 DNA 底物，回收酶切产物，在 22℃下使用 T4 DNA Ligase (Fast) 可以将超过95% 的酶切产物重新连接。将连接产物再次回收后，使用相同的内切酶可以重新切开 95% 以上的连接产物。 

非特异性内切酶活性检测

最适反应温度下，将 1ul LabFD™ AgeI 与 1ug 超螺旋质粒 DNA 共同温育 4h，使用琼脂糖凝胶电泳检测，质粒 DNA 仍然处于超螺旋状态。

蓝白斑检测

使用 1μl  LabFD™ AgeI消化含有 lacZα 基因且仅在该基因上具有1个酶切位点的特定载体。将酶切产物重新连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，涂布在含有X-gal、IPTG 和相应抗生素的LB平板培养基上生长。成功连接的β-半乳糖苷酶基因可以正确表达，并生长出蓝色菌落；而因酶切末端降解等原因未能重新连接的产物将得到白色菌落。对于 LabFD^TM 系列限制酶而言，白色菌落的比例应当小于 1%。

 

使用方法

1.DNA 快速酶切流程

（1）在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系：

	质粒 DNA	PCR 产物	基因组 DNA
ddH2O	15ul	16ul	30ul
10×LabFD™ Buffer 或 10×LabFD™ Color Buffer	2ul	3ula	5ul
底物 DNA	2ul(up to 1ug)	10ul(~0.2ug)	10ul(5ug)
LabFD™ AgeI	1ul	1ul	5ul
Total	20ul	30ul	50ul

a. 本体系适用于经过纯化的 PCR 产物酶切。未纯化的 PCR 产物具备一定的离子强度，10× LabFD™ Buffer 加入量可适当减少至2μl。但由于DNA 聚合酶同时具有外切酶活性，会影响酶切产物，因此如下一步需进行克隆等操作，建议酶切前对PCR产物进行纯化。

（2）轻柔吸打或轻弹管壁以混匀（切勿涡旋），然后瞬时离心以收集挂壁液滴；

（3）37℃温育 15min（质粒），或 15~30min（PCR 产物），或 30~60min（基因组 DNA）；

（4）80℃温育 20min 即可使酶失活，停止反应（可选）。

（5）如果使用 LabFD™ Color Buffer 进行酶切反应，得到的产物可以直接进行上样电泳。

 

2.双酶切或多酶切

（1）每种快速内切酶的用量为 1ul，并根据需要适当扩大反应体系；

（2）所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的 1/10；

（3）如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同，应先以最适温度低的酶开始酶切，再添加最适温度较高的酶，在其最适反应温度下进行酶切反应。

 

3.适用于质粒的扩大反应体系

注：如果总反应体系大于 20ul，应适当增加温育时间，尽量使用水浴、金属浴或沙浴。

DNA	1ug	2ug	3ug	4ug	5ug
LabFDTM AgeI	1ul	2ul	3ul	4ul	5ul
10×LabFD™ Buffer 或 10×LabFD™ Color Buffer	2ul	2ul	3ul	4ul	5ul
Total	20ul	20ul	30ul	40ul	50ul

 

不同 DNA 中的酶切位点数量

λDNA	ΦX174	pBR322	pUC57	pUC18/19	SV40	M13mp18/19	Adeno2
13	0	0	0	0	0	0	5

 

甲基化修饰影响

Dam	Dcm	CpG	EcoKI	EcoBI
无影响	无影响	剪切受阻	无影响	无影响

 

在不同反应缓冲液中的活性

	LabFD™ Buffer	Thermo Scientific FastDigest Buffer	NEB CutSmart®Buffer	Takara QuickCut™Buffer
活性	100%	50%	100%	50%

注：活性数据来自 LABLEAD 限制酶标准反应体系下的检测。

 

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