真空过滤系统，500ml，0.2umCN膜，50mm直径，灭

Northern blotting实验方案

交联。 5.6.10 将胶和紫外交联后的膜，在紫外灯下检测转移效率。(避免太长的紫外曝光时间) 5.6.11 将膜在-20℃保存。 5.7 探针的制备 5.7.1 在1.5 ml离心管中配制以下反应液： 模板DNA(25 ng) 　1ul Random Primer 2ul 灭菌水 11ul 总体积： 14ul 5.7.2 95°C加热3分钟后，迅速放置于冰冷却5 min。

RNA的电泳，转膜和杂交

，冰上放置5min 13.13探针：取出杂交管倒去杂交液，加入15ml杂交液，将探针加入,盖紧，于64℃杂交过夜 14.洗膜，压片：将杂交管中液体倒出，先加少量洗膜液Ⅰ，冷洗5min，倒出，再多加些洗膜液Ⅰ，冷洗10min，将膜取出测信号，根据信号大小决定是否热洗，若信号高，用洗膜液Ⅱ，Ⅲ继续洗，直到信号值达到适宜值为止，即膜上某一区域信号强，而其他区域信号弱代表杂交上了，然后包膜压片，放于-20℃或-80℃3天左右即可洗X片。 15.结果观察与分析

酵母双杂交筛选

效率 = = 5 X 105cfu/μg 21)筛库完成，菌在SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT 平板上生长7-14 天后，会有阳 性克隆生长出来，阳性克隆一般大于3mm。挑取少量菌做膜检(方法见3)。 从膜检变蓝的酵母菌中抽提prey 质粒与Bait 质粒做共转验证。 2.4.2 筛选小文库 2.4.2.1 转化法 1)5~10 个2mm 克隆接种于2ml SD/-Trp 液体培养基中，摇20 小时(过夜)，至 OD600=1.2 左右。