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基因点突变细胞系构建服务
1. 点突变技术背景
构建细胞点突变模型的理论基础是基因的同源重组修复。当基因组DNA双链由于外部因素而断裂时，细胞中存在的DNA修复机制就会被激发，对断裂位点的DNA双链进行修复，根据修复方式的不同可分为同源重组修复（Homologous directed repair,HR）和非同源重组修复（Non-homologous end join, NHEJ）。
同源重组修复（HR）是指DNA在修复的过程中以同源的DNA序列作为模板进行完美修复。
非同源重组修复（NHEJ）是指细胞内的相关蛋白直接将断裂的DNA两端重新连起来，可能会随机引入或缺失一定数量的碱基。
粒曼点突变细胞系构建基于CRISPR/Cas9基因编辑技术、实现在细胞特定位点切割，并引入突变位点，对于上述方法构建的点突变细胞，没有引入任何额外的报告或抗性基因，可以最大限度保持对基因组非编辑位点的影响。
2. 粒曼点突变细胞系服务介绍
2.1细胞系背景类型
可编辑人或小鼠来源的肿瘤细胞、正常组织细胞系、胚胎干细胞及免疫细胞等，粒曼现有200+种细胞基因成功编辑经验。
2.2靶点及点突变位点
客户只需要提供靶点Gene Symbol及点突变位点信息，粒曼10年以上海外专研基因编辑团队，在24h内出具设计方案。
客户填写信息
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1.Gene Symbol |
A基因 |
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2.突变位点 |
A基因的第42位氨基酸，AAG突变成AGG。 |
2.3交付内容
细胞系：点突变阳性单克隆细胞株。我司提供多种细胞交付方式，如WT细胞+点突变细胞同时交付、客户可选择冻存管或T25活细胞。我司提供细胞系相关的所有售后，包括客户细胞培养不成功，细胞功能验证不通过，细胞系多次传代后的Sanger验证数据分析等服务。
点突变细胞系构建报告：详细说明细胞培养方法、细胞构建流程、Sanger测序报告及原始数据。
3. 点突变细胞系服务流程
4. 粒曼点突变方法优势
1. 技术优势：对于上述方法构建的点突变细胞，没有引入任何额外的报告或抗性基因，可以最大限度保持对基因组非编辑位点的影响。
2. 方案设计：10年以上海外专研基因编辑团队，精心优化设计点突变方案，全方位考虑sgRNA切割PAM区域、donor序列的位置长度及修饰、测序验证引物的结合位点等多个细节。
3. 转染优势：粒曼生物200+细胞成功编辑经验，保证转染效率的基础上，可很大程度的提高点突变成功率。
4. 单克隆筛选：粒曼生物已实现自动化单克隆铺板及挑选，通过大量的单克隆测序，高效筛选阳性克隆
5. 应用场景参考
1．基因功能研究
通过引入特定位点的单一核苷酸突变，解析特定基因的功能，观察突变后细胞或生物体的表型变化，确定该基因在生物过程中的具体作用。
1）基因功能验证与表型分析
研究人员通过引入特定的TP63基因点突变[1]，创建了体外和体内模型，通过观察突变对卵母细胞的影响，验证了TP63突变在早发性卵巢功能不全（POI）发病机制中的作用。研究发现6个TP63基因突变导致TAp63α蛋白C端的转录抑制结构域功能受损，引发TAp63α蛋白从封闭的失活二聚体构象转变为开放的激活型四聚体，自发激活下游凋亡相关靶基因的表达，进而诱导卵母细胞凋亡，最终导致POI的发生。
2）研究基因相互作用
通过点突变改变蛋白质的关键氨基酸，研究其结构功能关系和蛋白质相互作用。研究人员构建一系列含NPHS2突变的人诱导多能干细胞(iPSC)细胞系，揭示了突变体对蛋白质表达水平和定位的影响，检测了PODOCIN-NEPHRIN的相互作用，发现突变体会导致编码PODOCIN蛋白的错误转运[2]。
2．疾病机制研究
点突变在研究疾病机制中起到关键作用。通过引入和分析基因中的特定位点突变，可以深入理解疾病的分子基础，发现致病基因及其突变如何导致疾病的发生和发展。
1）肿瘤发生与发展机制
研究发现p53热点突变蛋白p53R175H可特异性与转录因子BACH1结合[3]，发挥双重作用：一方面，解除BACH1对SLC7A11下调作用，从而抑制铁死亡，促进肿瘤生长；另一方面，通过上调促转移靶点的表达，促进BACH1依赖的肿瘤转移。
2）肿瘤微环境与免疫
在非小细胞肺癌的研究中发现，EGFR突变激活提高了肿瘤细胞中CD55和CD59的表达，进而抑制补体激活介导的肿瘤微环境中免疫细胞功能，最终达到肿瘤免疫逃逸[4]。
另一研究发现，NF2的错义突变包括L46R、L64P和L141P，能够通过相分离诱导形成细胞凝聚体，从而消除TBK1的激活、阻断cGAS-STING信号、进而抑制抗肿瘤免疫过程[5]。
3）其他疾病研究
研究人员对染色质架构蛋白CTCFR567W点突变[6]，构建小鼠模型和人源类器官模型，揭示了该突变通过调控CTCF在染色质上的结合和局部三维基因组结构，进而导致神经发育障碍的分子机制。这一发现为理解CTCF突变导致临床发育疾病提供了重要见解。
3．药物研发
在药物研发过程中，点突变可以用于筛选药物靶点。通过引入突变来模拟药物靶点基因的变化，评估候选药物的有效性和特异性以及研究药物耐药性机制。
1）筛选药物靶点
研究揭示了Kir4.1钾通道是具有高度治疗和研发价值的新型快速抗抑郁药物靶点[7]，并通过一系列实验证实了E158，I159及T128残基是小分子发挥抑制效能的关键位点，同时构建了I159A点突变的小鼠模型，发现抑制剂的快速抗抑郁药效被取消。
2）耐药机制研究
在非小细胞肺癌（NSCLC）中，EGFR T790M 突变是对第一代和第二代酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药的重要原因。通过研究EGFR T790M和其他突变，科学家们开发了第三代TKI如Osimertinib[8]。
KRAS突变常见于多种癌症，但有效的KRAS抑制剂治疗仍面临挑战，因为肿瘤细胞容易产生耐药性。研究人员通过引入特定的KRAS点突变，探讨了这些突变如何改变KRAS蛋白的结构和功能，揭示了肿瘤细胞通过调节蛋白质稳态网络来产生耐药性的具体机制[9]。
4．进化研究
通过点突变研究基因的进化路径和机制，了解不同物种间的基因变异及其功能意义，有助于揭示生命演化的复杂性和多样性。
1）研究致病基因进化
研究发现SHANK2BY29X对SHANK2不同转录本产生差异性影响，进而选择性损害了ALDH1A1阴性多巴胺神经元早期发育，并通过患者来源iPSC细胞诱导分化模型和转基因小鼠模型，验证了SHANK2BY29X遗传变异在导致孤独症谱系障碍ASD相关社交障碍中的潜在作用[10]。
2) 研究物种进化
通过对人类和猩猩的大脑类器官进行深入研究[11]，发现一种名为 ZEB2 的基因差异与人类和猿类大脑类器官差异密切相关，通过对 ZEB2突变延迟激活，发现猿类神经祖细胞的成熟也被延迟了，揭示了ZEB2 基因的延迟激活可能是人类大脑与猿类大脑差异的主要因素。这些究有研助于揭示人类与其他灵长类在脑功能和进化上的不同。
粒曼提供包括但不限于以上应用的点突变服务，我们技术成熟，效率高，服务好，欢迎咨询！
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文献和实验[1] Huang C,Zhao S,et al.TP63 gain-of-function mutations cause premature ovarian insufficiency by inducing oocyte apoptosis. J Clin Invest. 2023 Mar 1;133(5):e162315.
[2] Dorison A, Ghobrial I,et al. Kidney Organoids Generated Using an Allelic Series of NPHS2 Point Variants Reveal Distinct Intracellular Podocin Mistrafficking. J Am Soc Nephrol. 2023 Jan 1;34(1):88-109.
[3] Su Z, Kon N, et al.Specific regulation of BACH1 by the hotspot mutant p53R175H reveals a distinct gain-of-function mechanism. Nat Cancer. 2023 Apr;4(4):564-581.
[4] Shao, F.,Gao,Y., et al.Silencing EGFR-upregulated expression of CD55 and CD59 activates the complement system and sensitizes lung cancer to checkpoint blockade. Nat Cancer .2022 (3), 1192–1210.
[5] Meng F, Yu Z,et al. Induced phase separation of mutant NF2 imprisons the cGAS-STING machinery to abrogate antitumor immunity. Mol Cell. 2021 Oct 21;81(20):4147-4164.e7.
[6] Zhang J,Hu G,et al.CTCF mutation at R567 causes developmental disorders via 3D genome rearrangement and abnormal neurodevelopment.Nat Commun.2024 Jul 1;15(1):5524.
[7] Zhou, X.,Zhao, C.et al.Pharmacological inhibition of Kir4.1 evokes rapid-onset antidepressant responses. Nat Chem Biol.2024,20, 857–866.
[8] Mok, T. S. K., et al.Osimertinib or platinum–pemetrexed in EGFR T790M–positive lung cancer. N. Engl. J. Med.,2021,376(7), 629-640.
[9] Lv X, Lu X,et al.Modulation of the proteostasis network promotes tumor resistance to oncogenic KRAS inhibitors. Science. 2023 Sep 8;381(6662):eabn4180.
[10]Lai W, Zhao Y,et al.Autism patient-derived SHANK2BY29X mutation affects the development of ALDH1A1 negative dopamine neuron. Mol Psychiatry. 2024 May 4.
[11]Benito-Kwiecinski S, Giandomenico SL,et al.An early cell shape transition drives evolutionary expansion of the human forebrain. Cell. 2021 Apr 15;184(8):2084-2102.e19.
移植动物模型肿瘤生长及转移速度较快，可用来评价乳腺癌发生发展及转移过程中免疫应答的作用。异种移植一般采用人源组织或细胞接种于免疫缺陷小鼠（如重度免疫缺陷鼠 NCG），能模拟人恶性肿瘤成瘤后过程，可用于基础和临床研究。但人乳腺癌存在不同的分子分型，且人乳腺癌细胞系相对于其他癌种成瘤难度更大，且不稳定，因此选择合适的细胞系也十分重要。针对乳腺癌不同的分子分型，集萃药康细胞资源库配备丰富的乳腺癌细胞株以及热门靶点人源化改造的细胞资源，用于构建乳腺癌移植瘤模型。 表 1. 部分集萃药康乳腺癌细胞资源展示
性与科学性。 比如免疫缺陷鼠（NCG/NSG小鼠、裸鼠等），代谢特殊且免疫力低下，普通饲料中的微生物、过敏原可能引发感染，定制饲料会采用辐照灭菌工艺，剔除致敏成分，额外强化维生素、氨基酸，助力模型稳定构建。而肥胖、糖尿病等代谢类实验，可精准调控饲料中糖、脂比例，贴合实验设计的核心需求。 定制饲料的核心优势，在于“精准控变量”：严格控制原料品质，杜绝农药残留、微生物超标；按需调整营养成分，避免营养失衡干扰实验；适配特殊模型需求，提升实验重复性和数据可靠性，不少科研团队反馈，使用定制饲料后，模型构建
这里说的稳转细胞系的构建是指慢病毒转染构建的稳转细胞系，可以构建表达细胞系，也能构建敲降细胞系，经常有人问我什么叫稳转和顺转的区别。瞬转细胞系，一般情况下能够稳定表达最多长一周左右，而稳转细胞系，只要构建成功就能稳定表达，没有时间限制，但是也不是肯定的，一般实验构建的细胞系超过 10 代以后，这个细胞系就有可能不靠谱了。接下来，咱们讲讲稳转细胞系的构建。一般来讲 shRNA 用的是 HIV 病毒，虽然已经经过处理，但是一听这名字也觉得渗人，无论如何保护自己是在实验室永葆青春的基础，所以一定
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