pcDNA3.1-ACE2-Flag

产品简介：
pcDNA3.1-ACE2-Flag是碧云天研发的哺乳动物细胞表达质粒，用于表达C端带有FLAG标签(DYKDDDDK)的人血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme2，ACE2)蛋白，可以方便使用抗Flag标签的抗体来识别ACE2蛋白的表达，或进行免疫共沉淀分析等。该质粒含有CMV启动子，可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达，质粒为氨苄青霉素抗性。

ACE2是肾素-血管紧张素系统(Rennin-angiotension system，RAS)的重要成员。血管紧张素(Angiotensin II，Ang II)是RAS系统的主要效应分子，具有促进内皮细胞凋亡和促进炎症因子表达的作用。ACE2主要是通过降解血管紧张素II生成血管紧张素1-7(angiotensin-(1-7))从而发挥机体保护功能。ACE2是在肺、心脏、肾脏和肠中表达的I型膜蛋白，其胞外域包括N端肽酶结构域(Peptidase domain，PD)及C端Collectrin-like结构域(CLD)。ACE2是S-ARS冠状病毒(S-ARS-CoV和S-ARS-CoV-2)和人类呼吸道冠状病毒NL63的受体。S-ARS-CoV/S-ARS-CoV-2通过其Spike蛋白受体结合域(Receptor binding domain，RBD)与ACE2的肽酶结构域结合，参与病毒的感染过程。S-ARS-CoV-2 Spike蛋白与ACE2的亲和力是S-ARS-CoV Spike蛋白与ACE2的亲和力的10-20倍。

pcDNA3.1(+)-ACE2-Flag质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	232-819
T7 promoter and T7 primer binding site	863-882
Multiple cloning site	895-922
ACE2	923-3337
Flag-tag	3338-3361
BGH pA	3408-3632
f1 origin of ss-DNA replication	3678-4106
SV40 promoter	4111-4454
Neomycin resistance ORF	4516-5310
SV40 polyA signal	5484-5614
pUC origin	5997-6667
Ampicillin resistance ORF	6812-7808
bla promoter	7707-7713

pcDNA3.1-ACE2-Flag质粒(7808bp)的图谱如下：

pcDNA3.1-ACE2-Flag的多克隆位点的详细图谱见说明书

pcDNA3.1-ACE2-Flag中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pcDNA3.1-ACE2-Flag)包括：

AfeI	AgeI	AscI	AsiSI	BaeI	BlpI	BmgBI
BsiWI	BsmBI	BspEI	BsrGI	BstEII	BstXI	Bsu36I
Esp3I	FseI	HpaI	NotI	PacI	PmlI	SbfI
SfiI	SgrAI	SrfI	SwaI

pcDNA3.1-ACE2-Flag中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pcDNA3.1-ACE2-Flag)包括：

Acc65I	G`GTAC,C	917	NarI	GG`CG,CC	4644
AflII	C`TTAA,G	908	NheI	G`CTAG,C	895
ApaI	G,GGCC`C	3381	NruI	TCG|CGA	208
AvrII	C`CTAG,G	4434	PaeR7I	C`TCGA,G	3365
BamHI	G`GATC,C	1992	PflFI	GACN`N,NGTC	4762
BcgI	,NN` (N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN`	7390	PluTI	G,GCGC`C	4647
BmtI	G,CTAG`C	899	PshAI	GACNN|NNGTC	2751
BsaBI	GATNN|NNATC	4503	PspOMI	G`GGCC,C	3377
BspDI	AT`CG,AT	3273	PspXI	VC`TCGA,GB	3365
BssHII	G`CGCG,C	5041	PvuI	CG,AT`CG	7255
BstBI	TT`CG,AA	5326	RsrII	CG`GWC,CG	5160
BstZ17I	GTA|TAC	5616	SacI	G,AGCT`C	818
ClaI	AT`CG,AT	3273	SacII	CC,GC`GG	1579
CspCI	,NN` (N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN`	626	SfoI	GGC|GCC	4645
DraIII	CAC,NNN`GTG	3911	SmaI	CCC|GGG	4457
EagI	C`GGCC,G	4550	SnaBI	TAC|GTA	590
Eco53kI	GAG|CTC	816	SpeI	A`CTAG,T	249
EcoRI	G`AATT,C	2722	TspMI	C`CCGG,G	4455
EcoRV	GAT|ATC	3001	Tth111I	GACN`N,NGTC	4762
KasI	G`GCGC,C	4643	XbaI	T`CTAG,A	3371
KpnI	G,GTAC`C	921	XhoI	C`TCGA,G	3365
MluI	A`CGCG,T	228	XmaI	C`CCGG,G	4455
MscI	TGG|CCA	4726

pcDNA3.1-ACE2-Flag质粒中推荐使用的测序引物序列如下：

pcDNA3.1primer (829-848): 5'- CTAGAGAACCCACTGCTTAC -3'

BGH pA primer (3402-3419): 5'- TAGAAGGCACAGTCGAGG -3'

pcDNA3.1-ACE2-Flag的全序列信息: D2949 pcDNA3.1-ACE2-Flag序列.txt。

pcDNA3.1-ACE2-Flag质粒转染HKE293T细胞后的表达效果请参考图1:

图1：Western blot实验检测S-ARS-CoV-2 N基因在HEK293T细胞的表达。1.转染pcDNA3.1空载质粒；2.转染pcDNA3.1-S-ARS-CoV-2-ACE2-Flag质粒。使用碧云天Lipo8000™转染试剂(C0533)将2µg pcDNA3.1或pcDNA3.1-S-ARS-CoV-2-ACE2-Flag质粒转染六孔板中密度为80%左右的HEK293T细胞，37℃恒温培养48h后，弃掉孔内培养液，PBS洗涤三遍后加入150µl Western及IP细胞裂解液(P0013)充分裂解，4℃离心，取上清用BCA法测蛋白浓度，然后经浓度4-20%的预制胶(P0524)电泳，每孔蛋白总量20µg，转膜、封闭后使用1:1000稀释的Myc抗体(AM926)室温孵育1h，洗涤后1:1000稀释的二抗(A0192)室温孵育1h，最后经BeyoELC Star(P0018AS)化学发光，并使用BeyoImager™ 600化学发光成像系统(EI600)拍照记录。

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。