pCMV-N-Flag-miniTurboID (邻近蛋白生

产品简介：
pCMV-N-Flag-miniTurboID (邻近蛋白生物素标记质粒)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞、果蝇、线虫中表达N端融合3X Flag标签和miniTurboID的目的蛋白以用于生物素标记与其相互作用的目的蛋白的质粒。在ATP和生物素(Biotin)存在的条件下，miniTurboID融合蛋白根据其是否保留linker，能对10nm或35nm半径内无论是直接相互作用的蛋白还是邻近的蛋白任意暴露在外的赖氨酸残基进行生物素标记，后续可通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白，并通过质谱(Mass spectrometry, MS)鉴定相互作用的蛋白(图1)。邻近蛋白生物素标记质粒在筛选和鉴定生物体内的蛋白与蛋白相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用[1-3]。

图1. 碧云天邻近蛋白生物素标记质粒的工作原理图。

邻近依赖的生物素标记鉴定(Proximity-dependent biotin identification, BioID)技术是基于来源于E.coli生物素连接酶(Biotin ligase, BirA)的R118G突变体BirA*。BirA可在ATP存在的条件下，高效活化生物素(D-Biotin)形成生物素酰-5'腺苷酸(Biotinoyl-5'-AMP)，并特异性地将生物素连接到Avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE)的赖氨酸残基上，从而对目的蛋白进行快捷、高效的生物素标记；但由于来源于大肠杆菌的BirA*发生R118G突变，其活化的生物素酰-5'腺苷酸不再特异性修饰Avi标签的赖氨酸残基，而是可以对与其邻近的(~10nm)任意暴露在外的蛋白赖氨酸残基进行生物素标记。

BioID具有如下优点：①适用范围广：BioID融合蛋白可以在大部分细胞中表达，除了直接相互作用的蛋白，一定范围内相邻近的蛋白也会被生物素标记，便于研究天然情况下目标蛋白与周围蛋白的相互作用；适合空间和时间上细胞的动态过程的研究，还可以提供动力学数据。②敏感性高：BioID可以有效识别无法通过酵母双杂交(Yeast two hybrid, Y2H)或亲和纯化检测的体内蛋白与蛋白之间微弱、短暂的相互作用。③克服溶解度难题：BioID特别适合研究在酵母双杂交中可溶性差或较难纯化的蛋白。④标记的蛋白易纯化、背景低：蛋白经BioID标记生物素后与Streptavidin磁珠或凝胶结合紧密，可用强去垢剂(可耐受2% SDS)洗涤，消除非特异性结合蛋白，降低背景。

本产品中采用的miniTurboID是BioID的改进增强版本。miniTurboID是利用酵母表面展示(Yeast surface display)基于E.coli生物素连接酶人工改造获得的TurboID的基础上，进一步截短、突变得到的新型生物素连接酶。miniTurboID技术和BioID相比具有多方面的优点。①更灵活的生物素标记半径：在质粒构建时可通过选择不同的酶切位点，在miniTurboID和诱饵蛋白之间调节是否表达linker (13X GGGGS repeats, ~25nm)控制邻近蛋白生物素标记的半径，不表达linker的miniTurboID融合蛋白生物素标记半径为~10nm，而表达linker的miniTurboID融合蛋白生物素标记半径为~35nm (图2)。这种生物素标记半径选择的灵活性，适合研究体积较大的蛋白和较大的蛋白复合物。②更好的生物素标记效果：BioID分子量约35kDa，而miniTurboID分子量仅约28kDa，因此miniTurboID对融合蛋白功能的影响更小，空间位阻也更小，更容易接近被标记蛋白并产生更好的标记效果。③更高的生物素连接酶活性：BioID通常需要16小时才能有效标记相互作用的蛋白质，而miniTurboID最快10分钟就可以达到相似的效果。④更宽的反应温度范围：BioID反应温度低于37℃时酶活明显降低，虽然miniTurboID的最佳反应温度为30℃，但是miniTurboID在16℃-37℃也具有良好的生物素标记活性[4]。

图2.碧云天pCMV-N-Flag-miniTurboID质粒灵活的生物素标记半径原理图。①和②不同的酶切位点形成不同的生物素标记半径。

碧云天各种邻近蛋白生物素标记质粒的比较和选择

本质粒含有CMV启动子，可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达；表达的融合蛋白带有3X Flag标签便于检测；带有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性和新霉素(Neomycin)抗性，可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌；转染哺乳动物细胞后，可使用G418 (ST081)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株，G418和新霉素效果一致，但G418的细胞毒性更低。

pCMV-N-Flag-miniTurboID质粒(6434bp)的图谱如下：

pCMV-N-Flag-miniTurboID质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	235-818
3X Flag Tag	926-991
miniTurboID	998-1768
13X GGGGS repeats linker	1775-1972
Multiple Cloning Sites	1973-2001
BGH poly(A) signal	2034-2258
f1 ori	2304-2732
SV40 promoter	2746-3075
Neomycin resistance gene	3142-3936
SV40 poly(A) signal	4110-4231
lac operator	4304-4320
CAP binding site	4373-4394
ori	4682-5257
Ampicillin resistance gene	5438-6298
Ampicillin promoter	6299-6403

pCMV-N-Flag-miniTurboID表达基因的详细图谱见说明书

pCMV-N-Flag-miniTurboID中没有的酶切位点包括：

AarI	AbsI	AccIII	AcvI	AfeI	AgeI	AjiI
AjuI	AleI	Aor13HI	Aor51HI	AscI	AsiGI	AsiSI
AxyI	BaeI	BarI	BbrPI	BlpI	BmgBI	BoxI
Bpu1102I	B-se21I	B-seAI	BsgI	BshTI	BsiWI	BsmBI
Bsp13I	Bsp1407I	Bsp1720I	BspEI	BsrGI	BstAUI	BstEII
BstHPI	BstPI	BstPAI	Bsu36I	BtrI	CciNI	CelII
Cfr42I	CspAI	Eco47III	Eco72I	Eco81I	Eco91I	EcoO65I
Esp3I	FseI	FspAI	HpaI	I-CeuI	I-PpoI	I-SceI
KflI	Kpn2I	KspI	KspAI	MauBI	MreI	MroI
NotI	OliI	PacI	PalAI	PaqCI	PasI	Pfl23II
PI-PspI	PI-SceI	PinAI	PmaCI	PmlI	PpuMI	PshAI
Psp5II	PspCI	PspEI	PspLI	PspPPI	PsrI	RgaI
RigI	SacII	SanDI	SfaAI	SfiI	Sfr303I	SgfI
SgrBI	SgsI	SmiI	SrfI	SspBI	SstII	SwaI
TstI

pCMV-N-Flag-miniTurboID中的单酶切位点包括：

AflII	AhdI	AvrII	BamHI	BbsI	BbvCI	BglII
BsmI	BspDI	BssHII	BstBI	BstXI	BstZ17I	ClaI
EagI	Eco53kI	EcoNI	EcoRI	EcoRV	HindIII	KpnI
MluI	NdeI	NheI	NruI	PciI	PflFI	PflMI
PvuI	RsrII	SacI	ScaI	SexAI	SgrAI	SgrDI
SnaBI	SpeI	SspI	TspMI	Tth111I	XbaI	XhoI

pCMV-N-Flag-miniTurboID质粒中推荐使用的测序引物序列如下：

CMV-F (769-789): 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'

BGH-R (2045-2028): 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'

pCMV-N-Flag-miniTurboID的全序列信息:D3034 pCMV-N-Flag-miniTurboID-全长序列.txt

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。