pCMV-C-BioID2-Flag (邻近蛋白生物素标记质

产品简介：
pCMV-C-BioID2-Flag (邻近蛋白生物素标记质粒)是碧云天自行研发生产的一种用于在哺乳动物细胞中表达C端融合BiolD2和3X Flag标签的目的蛋白以用于生物素标记与其相互作用的目的蛋白的质粒。在ATP和生物素(Biotin)存在的条件下，BiolD2融合蛋白根据其是否保留linker，能对10nm或35nm半径内无论是直接相互作用的蛋白还是邻近的蛋白任意暴露在外的赖氨酸残基进行生物素标记，后续可通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白，并通过质谱(Mass spectrometry, MS)鉴定相互作用的蛋白(图1)。邻近蛋白生物素标记质粒在筛选和鉴定生物体内的蛋白与蛋白相互作用和探索相关功能方面发挥着至关重要的作用[1-3]。

图1. 碧云天邻近蛋白生物素标记质粒的工作原理图。

邻近依赖的生物素标记鉴定(Proximity-dependent biotin identification, BioID)技术是基于来源于E.coli生物素连接酶(Biotin ligase, BirA)的R118G突变体BirA*。BirA可在ATP存在的条件下，高效活化生物素(D-Biotin)形成生物素酰-5'腺苷酸(Biotinoyl-5'-AMP)，并特异性地将生物素连接到Avi标签(GLNDIFEAQKIEWHE)的赖氨酸残基上，从而对目的蛋白进行快捷、高效的生物素标记；但由于来源于大肠杆菌的BirA*发生R118G突变，其活化的生物素酰-5'腺苷酸不再特异性修饰Avi标签的赖氨酸残基，而是可以对与其邻近的(~10nm)任意暴露在外的蛋白赖氨酸残基进行生物素标记。

BioID具有如下优点：①适用范围广：BioID融合蛋白可以在大部分细胞中表达，除了直接相互作用的蛋白，一定范围内相邻近的蛋白也会被生物素标记，便于研究天然情况下目标蛋白与周围蛋白的相互作用；适合空间和时间上细胞的动态过程的研究，还可以提供动力学数据。②敏感性高：BioID可以有效识别无法通过酵母双杂交(Yeast two hybrid, Y2H)或亲和纯化检测的体内蛋白与蛋白之间微弱、短暂的相互作用。③克服溶解度难题：BioID特别适合研究在酵母双杂交中可溶性差或较难纯化的蛋白。④标记的蛋白易纯化、背景低：蛋白经BioID标记生物素后与Streptavidin磁珠或凝胶结合紧密，可用强去垢剂(可耐受2% SDS)洗涤，消除非特异性结合蛋白，降低背景。

本产品中采用的BiolD2是BioID的改进增强版本。BioID2基于来源于Aquifex aeolicus生物素连接酶(BirA)的R40G突变体，该突变体同样被称为BirA*，和大肠杆菌BirA的R118G突变体相似，都可以对与其邻近的任意暴露在外的蛋白赖氨酸残基进行生物素标记。BioID和BioID2都是邻近依赖的生物素标记鉴定技术，同时这两种技术分别使用的大肠杆菌来源的生物素连接酶突变体BirA(R118G)和嗜热菌Aquifex aeolicus来源的生物素连接酶突变体BirA(R40G)也被分别称为BioID和BioID2。

BioID2技术和BioID相比具有多方面的优点。①更灵活的生物素标记半径：在质粒构建时可通过选择不同的酶切位点，在BioID2和诱饵蛋白之间调节是否表达linker (13X GGGGS repeats, ~25nm)控制邻近蛋白生物素标记的半径，不表达linker的BioID2融合蛋白生物素标记半径为~10nm，而表达linker的BioID2融合蛋白生物素标记半径为~35nm (图2)。这种生物素标记半径选择的灵活性，适合研究体积较大的蛋白和较大的蛋白复合物。②更好的生物素标记效果：BioID分子量约35kDa (7.8nm×3.0nm)，而BioID2分子量仅约24kDa (为3.8nm×3.0nm)，因此BioID2对融合蛋白功能的影响更小，空间位阻也更小，更容易接近被标记蛋白并产生更好的标记效果。③更低的生物素浓度：BioID需在生物素浓度高于50μM的条件下才能有效标记相互作用的蛋白质，而BioID2在3.2μM生物素的条件下就可以有效标记相互作用的蛋白。BioID2所需生物素用量更少，降低了生物素对细胞功能的潜在影响。④更宽的反应温度范围：BioID最佳反应温度为37℃，而BioID2在37℃-55℃都具有良好的生物素标记活性。

图2. 碧云天pCMV-C-BioID2-Flag质粒灵活的生物素标记半径原理图。①和②不同的酶切位点形成不同的生物素标记半径。

碧云天各种邻近蛋白生物素标记质粒的比较和选择

本质粒含有CMV启动子，可以高效启动目的蛋白在细胞中的表达；表达的融合蛋白带有3X Flag标签便于检测；带有氨苄青霉素(Ampicillin)抗性和新霉素(Neomycin)抗性，可利用其氨苄青霉素抗性转化大肠杆菌后筛选阳性菌；转染哺乳动物细胞后，可使用G418 (ST081)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株，G418和新霉素效果一致，但G418的细胞毒性更低。

pCMV-C-BioID2-Flag质粒(6353bp)的图谱如下：

pCMV-C-BioID2-Flag质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	235-818
Multiple Cloning Sites	895-946
13X GGGGS repeats linker	947-1144
BioID2	1151-1846
3X Flag Tag	1853-1918
BGH poly(A) signal	1953-2177
f1 ori	2223-2651
SV40 ori	2845-2980
Neomycin resistance gene	3061-3855
SV40 poly(A) signal	4029-4150
lac operator	4223-4239
CAP binding site	4292-4313
ori	4601-5186
Ampicillin resistance gene	5357-6217

pCMV-C-BioID2-Flag表达基因的详细图谱见说明书

pCMV-C-BioID2-Flag中没有的酶切位点包括：

AarI	AbsI	AccIII	AccB7I	AcvI	AfeI	AgeI
AjuI	AleI	Aor13HI	Aor51HI	AscI	AsiGI	AsiSI
AxyI	BaeI	BanIII	BbrPI	BbvCI	BoxI	Bsa29I
B-se21I	B-seAI	B-seCI	BsgI	BshVI	BshTI	BsiWI
BsmBI	Bsp13I	Bsp1407I	BspDI	BspEI	BspXI	BsrGI
BstAUI	BstEII	BstHPI	BstPI	BstPAI	BstXI	Bsu15I
Bsu36I	BsuTUI	CciNI	Cfr42I	ClaI	CspAI	Eco47III
Eco72I	Eco81I	Eco91I	EcoO65I	Esp3I	FseI	FspAI
HpaI	I-CeuI	I-PpoI	I-SceI	KflI	Kpn2I	KspI
KspAI	MauBI	MreI	MroI	Nb.BbvCI	NotI	Nt.BbvCI
OliI	PacI	PalAI	PasI	Pfl23II	PflMI	PI-PspI
PI-SceI	PinAI	PmaCI	PmlI	PpuMI	PshAI	Psp5II
PspCI	PspEI	PspLI	PspPPI	PspXI	RgaI	RigI
SacII	SanDI	SbfI	SdaI	SfaAI	SfiI	Sfr303I
SgfI	SgrAI	SgrBI	SgsI	SmiI	SrfI	Sse8387I
SspBI	SstII	SwaI	TstI	Van91I	XcmI

pCMV-C-BioID2-Flag中的单酶切位点包括：

Acc65I	AflII	AhdI	ApaI	AvrII	BamHI	BbsI
BglII	BmgBI	BmtI	BsmI	BssHII	BstBI	BstZ17I
DraIII	EagI	Eco53kI	EcoRI	EcoRV	HindIII	KpnI
MfeI	MluI	MscI	NdeI	NheI	NruI	PaeR7I
PciI	PflFI	PspOMI	PvuI	RsrII	SacI	ScaI
SexAI	SgrDI	SmaI	SnaBI	SpeI	SspI	StuI
TspMI	Tth111I	XbaI	XhoI	XmaI

pCMV-C-BioID2-Flag质粒中推荐使用的测序引物序列如下：

CMV-F (769-789): 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'

BGH-R (1947-1964): 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3'

pCMV-C-BioID2-Flag的全序列信息:D3023 pCMV-C-BioID2-Flag -全长序列.txt

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。