pCMV-AT1.03 (ATP荧光探针)

产品简介：
pCMV-AT1.03 (ATP荧光探针)是碧云天自行研发的含有CMV启动子用于在哺乳动物细胞中表达AT1.03蛋白以作为ATP荧光探针的工具质粒。本质粒表达的ATP荧光探针被称为ATeam，即基于FoF₁-ATP合成酶ε亚基的ATP指示剂(Adenosine 5'-Triphosphate indicator based on Epsilon subunit for Analytical Measurements)。AT1.03是一种低亲和力的ATeam (Kd=3.3mM at 37℃)，可以检测毫摩尔级的ATP水平。pCMV-AT1.03质粒在转染哺乳动物细胞后，AT1.03蛋白主要分布在细胞质中，适合用于实时监控细胞质内的ATP浓度变化。

AT1.03蛋白是以荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)为基础的实时监测单个活细胞内的ATP水平及其实时变化的ATP荧光探针。该荧光探针由N端的青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein) mseCFPΔC11 (激发光波长435nm，发射光波长475nm)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的FoF₁-ATP合成酶的ε亚基以及C端的黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein) cp173-mVenus (激发光波长515nm，发射光波长527nm)融合而成(参考图1)。枯草芽孢杆菌的FoF₁-ATP合成酶的ε亚基是几乎最小的ATP结合蛋白(14kDa)，它由一个N端β桶状结构域和两个C端α螺旋结构域组成。作为基于FRET的ATP荧光探针，FoF₁-ATP合成酶的ε亚基具有几个突出优点：ε亚基与ATP结合，但不水解ATP；结合ATP，但不结合ADP、GTP、CTP以及UTP；当ATP结合时，ε亚基发生很大的构象变化形成一个折叠的构象(folded form)，从而使N端的青色荧光蛋白以及C端的黄色荧光蛋白得以在空间上接近，而发生荧光共振能量转移(激发光波长435nm，发射光波长527nm)。

图1.AT1.03蛋白结构图。

pCMV-AT1.03质粒转染Hela细胞后的ATP荧光探针表达效果请参考图2。

图2.pCMV-AT1.03质粒转染Hela细胞后的ATP荧光探针表达效果图。A图为明场照片，B图为荧光照片。

AT1.03的荧光信号在pH7.1-8.5之间非常稳定，这样AT1.03的荧光信号在正常细胞质内(pH7.3左右)几乎不会发生波动。ATP的结合常数_Kon为1.7×10^-2mM^-1s^-1，ATP的解离常数_Koff为9.8×10^-2s^-1，因此AT1.03可用于监控细胞内高达0.1s^-1 ATP的动态变化，特别适合用于实时监测超短时间内的ATP浓度变化。

本质粒为卡那霉素抗性，转染细胞后，可使用G418筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-AT1.03质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
CMV promoter	1–602
T3 promoter and T3 primer binding site	620–639
AT1.03	699-2534
multiple cloning site	651-692/2535-2558
T7 promoter and T7 primer binding site	2581–2629
SV40 polyA signal	2641–3024
f1 origin of ss-DNA replication	3162–3466
bla promoter	3491–3615
SV40 promoter	3635–3973
neomycin/kanamycin resistance ORF	4008–4799
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal	4800–5258
pUC origin	5387–6054

pCMV-AT1.03质粒(6106bp)的图谱如下：

pCMV-AT1.03的详细图谱见说明书

pCMV-AT1.03中没有的酶切位点(Restriction enzymes that do not cut pCMV-AT1.03)包括：

AclI	AfeI	AflII	AgeI	AhdI	AscI	AsiSI
BaeI	BbsI	BbvCI	BlpI	BsiWI	BsmBI	BspEI
BspQI	BssHII	BstEII	BstZ17I	EarI	EcoNI	Esp3I
FseI	HindIII	NruI	PflMI	PmeI	PmlI	PpuMI
PshAI	PspXI	SalI	SapI	SbfI	ScaI	SgrAI
SwaI	XcmI	XmnI

pCMV-AT1.03中的单酶切位点(Restriction enzymes that cut pCMV-AT1.03)包括：

AccI	GT`MK,AC	1432	NarI	GG`CG,CC	4136
ApaLI	G`TGCA,C	5740	NdeI	CA`TA,TG	240
BamHI	G`GATC,C	687	NheI	G`CTAG,C	597
BclI	T`GATC,A	2795	NotI	GC`GGCC,GC	672
BglII	A`GATC,T	2535	PaeR7I	C`TCGA,G	2541
BmgBI	CAC|GTC	1772	PciI	A`CATG,T	6054
BmtI	G,CTAG`C	597	PflFI	GACN`N,NGTC	4254
BsaI	GGTCTCN`NNNN,	5125	PluTI	G,GCGC`C	4135
BsaXI	,NNN`(N)9AC(N)5CTCC(N)7,NNN`	3185	PvuI	CG,AT`CG	2639
BsrDI	GCAATG,NN`	4367	RsrII	CG`GWC,CG	4652
BsrGI	T`GTAC,A	1990	SacI	G,AGCT`C	651
BstBI	TT`CG,AA	4818	SacII	CC,GC`GG	660
BstXI	CCAN,NNNN`NTGG	663	SfiI	GGCCN,NNN`NGGCC	3908
CspCI	,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN`	380	SfoI	GGC|GCC	4137
DraIII	CAC,NNN`GTG	3251	SmaI	CCC|GGG	682
Eco53kI	GAG|CTC	653	SnaBI	TAC|GTA	346
EcoRI	G`AATT,C	1791	SpeI	A`CTAG,T	2553
EcoRV	GAT|ATC	1445	SrfI	GCCC|GGGC	682
HincII	GTY|RAC	2901	StuI	AGG|CCT	3957
HpaI	GTT|AAC	2901	TspMI	C`CCGG,G	680
KasI	G`GCGC,C	4135	Tth111I	GACN`N,NGTC	4254
MfeI	C`AATT,G	2888	XbaI	T`CTAG,A	2547
MluI	A`CGCG,T	3024	XhoI	C`TCGA,G	2541
MscI	TGG|CCA	4218	XmaI	C`CCGG,G	680

如需对pCMV-AT1.03质粒中插入片段AT1.03进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物T7的序列如下：

T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'

T7 primer (2581–2629): 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'

pCMV-AT1.03的全序列信息:D2604 pCMV-AT1.03全序列.txt

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。