pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg

产品简介：
pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg是碧云天研发的用于在哺乳动物细胞中同时表达N端带有HA标签(HA Tag, YPYDVPDYA)的目的蛋白、红色荧光蛋白mCherry和潮霉素B (Hygromycin B)抗性基因的表达质粒。

本质粒含有CMV启动子可以高效启动目的基因的表达；可以方便地使用抗HA标签的抗体(AF5057/AF2305/AF0039/AH158)来检测目的蛋白；同时可以通过P2A共表达红色荧光蛋白mCherry，便于通过mCherry的荧光特性监测目的蛋白的表达情况。本质粒的表达效果可以参考图1。

图1. 碧云天pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒使用Lipo8000™转染试剂(C0533)转染293T细胞后的表达效果图。左侧为明场照片，右侧为荧光照片。本图仅供参考，实际拍摄效果会因具体实验条件的不同而有所不同。

本质粒在多克隆位点和mCherry的编码序列之间含有P2A肽序列。P2A是一个可以被理解为含有19个氨基酸残基(ATNFSLLKQAGDVEENPGP)的“自剪切”小肽。但实际的过程并不是发生自剪切，而是使核糖体跳过P2A等2A元件C端的甘氨酸和脯氨酸肽键的合成而发挥作用，最终导致2A序列末端和下游产物分离。上游目的基因表达蛋白的C端将会添加一些额外的P2A残基(GSGATNFSLLKQAGDVEENPG)，而下游蛋白的N端将会有额外的脯氨酸。在P2A肽的N端加入GSG序列，可提高剪切效率 [1,2]。

本质粒为氨苄青霉素(Ampicillin)和潮霉素B (Hygromycin B)抗性。可利用其氨苄青霉素抗性，转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。转染哺乳动物细胞后，可使用Hygromycin B (ST1389)筛选稳定表达目的蛋白的细胞株。

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒的主要信息如下：

Feature Nucleotide	Position
AmpR	63-923
AmpR promoter	924-1016
CMV enhancer	1101-1404
CMV promoter	1405-1608
T3 promoter	1654-1672
HA	1712-1738
P2A	1808-1873
mCherry	1874-2584
T7 promoter	2636-2654
SV40 poly(A) signal	2928-3049
f1 ori	3056-3511
AmpR promoter	3538-3642
SV40 promoter	3644-4001
SV40 ori	3852-3987
HygR	4036-5061
HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal	5293-5340
ori	5669-6257

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒(6365bp)的图谱如下：

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg的多克隆位点的详细图谱见说明书

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg中没有的酶切位点包括：

AarI	AbsI	AcvI	AfeI	AflII	AgeI	Aor51HI
AscI	AsiGI	BaeI	BbrPI	BfrI	BlpI	Bpu1102I
BsePI	BshTI	BsiWI	Bsp68I	Bsp1720I	BspQI	BspTI
BssHII	BssNAI	Bst98I	Bst1107I	BstAFI	BstENI	BstXI
BstZ17I	BtuMI	CelII	Cfr42I	CspAI	Eco47III	Eco72I
EcoNI	FseI	FspAI	I-CeuI	I-PpoI	I-SceI	KspI
LguI	MauBI	MreI	MspCI	MssI	NruI	PalAI
PauI	PciSI	Pfl23II	PI-PspI	PI-SceI	PinAI	PmaCI
PmeI	PmlI	PpuMI	Psp5II	PspCI	PspLI	PspPPI
PspXI	PsrI	RigI	SacII	SanDI	SapI	Sfr303I
SgrBI	SgrDI	SgsI	SmiI	SstII	SwaI	Vha464I
XagI

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg中的单酶切位点包括：

AccI	GT`MK,AC	1779	MluI	A`CGCG,T	3050
AleI	CACNN|NNGTG	2516	MscI	TGG|CCA	1904
ApaI	G,GGCC`C	2589	NdeI	CA`TA,TG	1274
AsiSI	GCG,AT`CGC	4400	NotI	GC`GGCC,GC	1701
BamHI	G`GATC,C	1748	PaeR7I	C`TCGA,G)	1790
BbsI	GAAGACNN`NNNN,	2309	PciI	A`CATG,T	6313
BbvCI	CC`TCA,GC	2412	PflFI	GACN`N,NGTC	4540
BcgI	NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN`	641	PshAI	GACNN|NNGTC	4063
BclI	T`GATC,A	2821	PspOMI	G`GGCC,C	2585
BglII	A`GATC,T	1784	RsrII	CG`GWC,CG	4444
BmgBI	CAC|GTC	1852	SacI	G,AGCT`C	1689
Bpu10I	CC`TNA,GC	2412	SalI	G`TCGA,C	1778
BsgI	GTGCAGNNNNNNNNNNNNNN,NN`	2468	SbfI	CC,TGCA`GG	2229
BsmBI	CGTCTCN`NNNN,	1842	SfiI	GGCCN,NNN`NGGCC	3939
BspDI	AT`CG,AT	4004	SgrAI	CR`CCGG,YG	2555
BsrGI	T`GTAC,A	2574	SmaI	CCC|GGG	1743
BstBI	TT`CG,AA	5077	SnaBI	TAC|GTA	1380
ClaI	AT`CG,AT	4004	SpeI	A`CTAG,T	1802
CspCI	NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN`	1416	SrfI	GCCC|GGGC	1743
EarI	CTCTTCN`NNN,	931	TspMI	C`CCGG,G	1741
Eco53kI	GAG|CTC	1687	Tth111I	GACN`N,NGTC	4540
EcoRI	G`AATT,C	1766	XbaI	T`CTAG,A	1796
EcoRV	GAT|ATC	1774	XcmI	CCANNNN,N`NNNNTGG	2560
Esp3I	CGTCTCN`NNNN,	1842	XhoI	C`TCGA,G	1790
HindIII	A`AGCT,T	1754	XmaI	C`CCGG,G	1741
HpaI	GTT|AAC	2927	XmnI	GAANN|NNTTC	735
MfeI	C`AATT,G	2914

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg质粒中对插入片段进行测序时，推荐使用的正向测序引物T3和反向测序引物mCherry primer的序列如下：

T3 primer (1654-1672): 5' AATTAACCCTCACTAAAGG 3'

mCherry primer (1876-1892): 5' CCTCGCCCTTGCTCACC 3'

pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg的的全序列信息:D2796 pCMV-N-HA-MCS-P2A-mCherry-Hyg.txt。

保存条件：

-20℃保存。

注意事项：

本质粒未经碧云天书面许可不得用于任何商业用途，也不得移交给订货人所在实验室外的任何个人或单位。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。