过氧蛋白同源物(PXDN)重组蛋白

捕获ELISA法

指南，用户需要确定自己的最佳实验条件以获取最好的成果。 2.1经由加入具有抗原特异性的抗体到适当的孔（1微克/孔）以加入捕获抗体，浓度应为10微克/毫升于涂层缓冲液中，量应为100μL/孔。※捕获抗体应该是纯化的抗体。2.2在4℃下孵育孔盘过夜。2.3加入250μl封闭液到每个孔中。2.4孵育孔盘于室温下1小时。2.5清空孔盘，用PBST（0.05％Tween-20）洗涤孔盘一次。2.6如果待测物为：A，重组蛋白-以稀释剂稀释待测物至100毫微克，30毫微克，10毫微克，3纳克，1纳克

抗体选择

特异性的选择主要需要考虑四个方面：蛋白特异性、种属特异性、实验方法特异性、标记物的特异性。 （1）蛋白特异性 针对需要检测的蛋白查找抗体，几个细节要区分，重组表达的蛋白和内源性蛋白的检测，对抗体的要求是不一样的，注意查看抗体说明书的检测说明。如果重组蛋白不是全长表达，则需要注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内。内源性蛋白最好能清楚其剪切与修饰的方式，特殊表型的蛋白需要进行序列比对，并结合抗体免疫原序列，查看交叉反应的情况。磷酸化蛋白检测需要确定具体位点，不同位点的磷酸化意味

免疫印迹（Western Blotting）实验

的缓冲液中），但不同的抗原-抗体反应，封闭条件均不相同，没有适合所有系统的封闭液，具体封闭条件（包括封闭液浓度、缓冲液种类、封闭时间、温度等）需自行优化。 注意事项 a. 影响非特异性结合的因素很多，针对不同的免疫原，其封闭条件均可进行优化，没有通用的封闭液，因为每个抗原-抗体反应都具有独特的性质； b. 在选择封闭物时，最重要的标准是信噪比，封闭条件不足，会导致过多的背景噪音，封闭条件过度，会造成信号变弱； c. 可根据不同的检测系统（碱性磷酸酶或辣根过氧