pFC14K (HaloTag® 8) CMV Flexi®

说明

目前，已有各种针对哺乳动物、大肠杆菌及无细胞蛋白表达系统的HaloTag® Flexi®Vectors(HaloTag® Flexi® 载体) 可选。这些载体与Flexi® 载体系统具有兼容性，是一种蛋白质编码序列的定向克隆方法，可将上述序列在各种Flexi® 载体间转移，快速、有效、高度保真，这些Flexi® 载体带有不同的蛋白或肽标签，可进行天然蛋白或融合蛋白的表达，表达出的蛋白可进行蛋白质结构和功能的研究，也可以进行蛋白: 蛋白相互作用研究。

用于哺乳动物蛋白表达的HaloTag® Flexi® 载体
右侧表格中所列举的载体最适宜用于哺乳动物蛋白表达。名称中带有“pFC”的载体都已被设计成将HaloTag® 蛋白标签添加到目的蛋白的羧基末端，名称中带有“pFN”的载体都已被设计成将HaloTag® 蛋白标签添加到目的蛋白的氨基末端。这些载体或者包含全长的人巨细胞病毒(CMV) 启动子(pFC14、pFN21)，或者包含经修饰的人巨细胞病毒(CMV) 启动子(pFC15、pFC16、pFC17、pFN22、pFN23、pFN24)。经修饰的CMV启动子带有不同的序列缺失，可根据目的蛋白及细胞类型的不同，产生不同的蛋白表达水平。有关蛋白表达水平的一般信息，请查看右侧表格。

用于大肠杆菌和无细胞蛋白表达系统的HaloTag® Flexi® 载体
pFN18 HaloTag® T7 Flexi® 载体被设计成将HaloTag® 蛋白加入到目的蛋白的氨基末端，并在大肠杆菌或无细胞翻译系统中提供T7RNA 聚合酶驱动的蛋白表达。
pFN19 HaloTag® T7 SP6 Flexi® 载体被设计成将HaloTag® 蛋白加入到目的蛋白的氨基末端，同时在大肠杆菌( 低于pFN18 载体大约2 到4 倍的蛋白表达) 中提供T7 RNA 聚合酶驱动的蛋白表达，或者在无细胞翻译系统中提供T7或SP6 RNA聚合酶驱动的蛋白表达。pFC20 HaloTag® T7 SP6 Flexi® 载体被设计成将HaloTag® 蛋白加入到目的蛋白的羧基末端，同时在大肠杆菌中提供T7 RNA 聚合酶驱动的蛋白表达，或者在无细胞翻译系统中提供T7 或SP6 RNA聚合酶驱动的蛋白表达。

注意：pHT2载体（Cat.# G8241）已停产，不适合细菌系统的蛋白表达。

HaloTag® Flexi® 载体中的HaloTag® 蛋白与已停产的pHT2载体中的HaloTag® 蛋白的差异比较
HaloTag® Flexi® 载体含有的HaloTag® 蛋白为HaloTag® 7，HaloTag® 7 在温度和变性剂方面提供增强的稳定性、更快的标记速度，因而与pHT2 HaloTag® 载体所含HaloTag® 2 蛋白相比，它的表达得到了显著的改善。

特点

• 灵活性：可从众多哺乳动物表达载体中选择满足您需要的最佳载体。

• 节省时间：序列能够在载体间有效地转移，使得重组克隆能够被直接利用，减少了浪费在筛选背景克隆上的时间。

• 多用性：可表达哺乳动物、大肠杆菌 或无细胞系统中的HaloTag® 融合蛋白。

Flexi® Vector Systems Technical Manual TM254
HaloTag® Technology: Focus on Imaging Technical Manual TM260
HaloCHIP™ System Technical Manual TM075
HaloLink™ Resin Technical Manual TM250

使用C 端HaloTag® Flexi® 载体制备HaloTag® 融合蛋白的方案概要( 详细方案，请参见 Flexi® 载体系统技术手册 TM254)

. Flexi® System, Entry/Transfer(Cat.# C8640)

• Carboxy Flexi® Enzyme Blend (SgfI and EcoICRI) (Cat.# R1901)

• N 末端Flexi® 载体( 如pFN21A、pFN21K)

注意： 融合到C 末端标签的蛋白编码序列就不能再在其它表达载体中转移了。如需使蛋白编码序列在多个载体之间转移，在将该序列转移到C 末端Flexi® 载体上之前，应先把该序列克隆到不带标签的Flexi® 载体上，或克隆到带N 末端标签的载体上。

1. 使用Flexi® 载体引物设计工具(Flexi® Vector Primer DesignTool)，为目的蛋白编码区设计引物。

2. 使用高保真DNA 聚合酶进行扩增，并纯化扩增产物。

3. 使用SgfI 和PmeI 消化扩增产物，纯化消化产物。

4. 使用SgfI 和PmeI 消化受体Flexi® 载体(N 端Flexi 载体)。

5. 加热，使限制酶失活；连接PCR 产物和受体Flexi® 载体。

6. 转化，铺板( 含有氨苄青霉素或卡那霉素的LB 板)。

7. 筛选克隆；测序验证插入片段。

使用N 端HaloTag® Flexi® 载体制备HaloTag® 融合蛋白的方案概要( 详细方案，请参见Flexi® 载体系统技术手册TM254)

Flexi® System, Entry/Transfer(Cat.# C8640)依照上面的“入门反应方案”。