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qPCR(mRNA)
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实时荧光定量PCR 技术于1996年由美国Applied Biosy stems公司推出,该技术不仅实现了对DNA模板的定量,而且具有灵敏度高、特异性强、准确可靠。能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时性好等特点。目前已广泛应用于mRNA定量研究,如基因表达研究、基因突变及多态性研究、肿瘤研究、转基因安全检测,动物中基因治疗载体的生物分布的确定、生物疗法中残留DNA的定量污染细胞库和终产物中病毒和细菌核酸检测、有效清除病毒研究中病毒清除水平的定量、疫苗中逆转录病毒活性的特异性检测、以及遗传稳定性监控中转基因拷贝数的确定等。应用前景越来越广阔。
一.原理介绍
qPCR(Real time Quantification PCR,qPCR,实时荧光定量 PCR)通过对荧光报告基团信号的检测及定量来对起始模板进行定量分析。反应过程中荧光信号的增加与扩增产物量成正比,当 PCR 进入指数扩增时,PCR 产物显著增加,此时 PCR 产物量与模板起始量相关,最终通过 CT 值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
SYBR Green I是一种能激发荧光的非对称花青染料,结合后使荧光信号增强800~1000倍,荧光信号强度DNA分子总量成正比。该方法是用带荧光的非特异DNA结合染料(SYBR Green I、LC Green I、SYTO 9、BEBO等)检测PCR扩增产物。最常用的是SYBR Green I,灵敏度高、成本低、简单易用。
二.实验步骤
1. RNA提取:参照RNA提取步骤
2. RNA琼脂糖凝胶电泳
RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶,不同的RNA条带也能分开,但无法判断其分子量。在需快速检测所提总RNA样品完整性时,配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。
(1)称取0.4g 琼脂糖,置于200ml 锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液,放入微波炉里加热,直到琼脂糖全部熔化,取出摇匀,立即清水冲洗至瓶温降至10度,加入EB摇匀,此为0.8%琼脂糖凝胶液,加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
(2)在超净工作台上,用移液器吸取总RNA样品4μl,小心加入点样孔,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
(3)加完样后,合上电泳槽盖,打开电源开关,调节电压60-80V,电流在40mA 以上,使RNA由负极向正极电泳,约15min后,条带移动到距凝胶前沿约2cm 时,停止电泳。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
RNA的电泳图谱,电泳的目的是在于检测28S、18S、5S条带的完整性和他们的比值,一般的,如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利,并且28S的亮度在18S条带的两倍以上,我们认为RNA的质量是好的。
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