冰冻切片的原理是利用低温冷冻技术将生物组织中的水分冻结成冰晶,然后通过切片机切割出所需的薄片。
在冷冻过程中,水分的形态转变为冰晶有利于维持组织的完整性,从而得到高质量的切片。此方法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤,因此特别适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片,是作为快速切片的方法应用于临床诊断。
冰冻切片(frozen section)是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度,然后进行切片的方法。因其制作过程较石蜡切片快捷、简便,而多应用于手术中的快速病理诊断。冰冻切片的种类较多,有低温恒冷箱冰冻切片法,二氧化碳冰冻切片法,甲醇循环制冷冰冻切片法等。这些方法,随着时代的变迁,科技的发展,许多年前被认为是非常重要的技术,也逐步被淘汰了。当然有些技术,如低温恒冷箱冰冻切片法,正在受到重视。
冰冻切片操作步骤一:取材
要进行冰冻切片观察的组织,应尽可能采取新鲜的材料,防止组织发生死后变化,影响后期染色分析结果。
冰冻切片的步骤二:速冻
1、将取好的组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内(直径约2 cm)。
2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织,将特制小盒缓缓平放入小杯内。
3、当盒底部接触时即开始气化沸腾,此时小盒保持原位切勿浸入,大约10-20 s组织即迅速冰结成块。
4、再制成冻块,使其可置入恒冷箱切片机冰冻切片。
5、若需要保存,应快速以铝箔或塑料薄膜封包,立即置入-80 ℃冰箱贮存备用。
冰冻切片的步骤三:固定
1、样品托上涂一层OCT包埋胶,将速冻组织置于其上,4℃冰箱预冷5-10 min让OCT胶浸透组织。
2、取下组织置于锡箔或者玻片上,样品托速冻。
3、组织置于样品托上,其上再添一层OCT胶,以完全覆盖为宜,速冻架(PE)上30 min。
冰冻切片的步骤四:切片
1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机,其基本结构是将切片机置于低温密闭室内,故切片时不受外界温度和环境影响,可连续切薄片至5-10 μm。
2、切片时,低温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜,温度过低组织易破碎,抗卷板的位置及角度要适当,载玻片附贴组织切片,切勿上下移动。
3、切好后,室温放置30 min后,入4℃固定5-10 min,烘箱干燥20 min。PBS洗5 min×3。
4、进行抗原热修复,微波热修复也可,室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5-10 min,消除内源性过氧化物酶的活性
1、组织取材对制片的影响
组织取材大小:组织块大小要适宜,冷冻切片机内切片刀移动的范围有一定的限制,超出其范围时,易致切片不全,一般情况下,冰冻切片的组织大小为1.5*1.5 cm厚2 mm。(卵巢及脂肪组织可稍微大些)组织块过大,切片时阻力过大,易产生皱折、刀痕,组织易崩碎,增加制片难度,影响观察诊断。
组织内含过多的脂肪或坏死组织:脂肪或坏死组织较一般的组织冷冻的温度要低些,当活组织达到所需的温度时,脂肪或坏死组织还比较软,从而影响切片的完整性和检测发出的时间。
组织块过冷:组织冷冻过度易致切片破碎或呈粉沫状,不能制作一张完整的切片。
组织块冷冻不均匀:组织块放入时不能保持水平状态且不足的情况下,可产生此现象。
2、冷冻时间、温度对制片的影响
根据组织块的大小性质确定冷冻时间一般13~17 s,若组织较大或脂肪组织时间可适当长些,而甲状腺、脑组织和淋巴组织等冷冻的时间相对要短些。
3、染色对制片的影响
尤以细胞核的染色最为关键,在寒冷的冬季,室温过低时,影响核的着色,可适当加温,用以增色;苏木毒的酸碱应适宜 ,经常观察其染液的n值,过碱时应及时更换,盐酸酒精分化活度,时间控制到位,否则易造成核着色不佳,染色质不清晰,影响诊断的准确性。
4、冰晶的形成对制片的影响
常见原因:取决于组织含水量的大小,尤以组织细胞水肿,淋巴结,纵隔肿瘤,卵巢肿瘤为甚,送检取材过程中接触水源,同是造成冰晶形成的原因。
解决方法:使用时间上控制到位,保证一次冻透标本1.组织送检取材时,尽量避开水源2.如遇含水量高的标本时,应尽量用干纱布吸干水分后再行冷冻。
5、切片皱缩或卷缩对制片的影响
常见的原因:①刀锋变钝。②防卷板粘有异物,防卷板的作用是防止切片卷缩,但若粘有异物,切片时组织会被挤压而缩在一起。③防卷板与刀锋的位置不平行、不协调。④组织块包埋不完全,缺乏支撑作用。
解决方法:①注意检查刀具,及时更换刀口,定期磨刀。②保持防卷板的清洁,每做一例冷冻切片,均应将刀口及防卷板拭擦干净,防止切片的污染和切片皱缩。③调整刀、防卷板的位置,保证两者平行,且防卷板次刀锋前0.2 mm左右。包埋组织应完全,没法切片者再滴加包埋胶。
6、组织块脱落对切片的影响。
冷冻切片一般要求在30min内发出病理报告,以便手术医生能尽快选择手术方式。
常见原因:①组织内含过多的坏死组织。组织细胞坏死崩解后,局部的渗透压升高,吸收水分,切片一经固定,水分逸出,坏死组织失去支撑作用,染色时组织容易脱落,②因际液浓度过低。③载坡片不干净。④切片太厚。
处理方法:①避免组织内带有坏死组织。②定期更换固定液。 股每周更换一次,例数较多者,适当增加次数。③保持载玻片干净,平时应将玻片盖好,防止就发申或其它异物的污染。④调好切片的厚度,切片厚度以5~7μm为宜。