在生物学研究中,活/死细胞染色试剂是一种非常重要的工具,它可以帮助我们区分活细胞和死细胞。这种试剂可以通过染色细胞膜上的磷脂来达到区分的目的。
细胞增殖和细胞死亡间平衡的维持对多种细胞有机的发育与生命的维持至关重要,其失衡将导致各种疾病的发生.如:人类平均每天有 6×10(10)个新细胞生成,同时又接近同等数量的成熟细胞被机体清除.在细胞增殖及细胞凋亡间存在一种配对关系,因此区分活细胞和死细胞对研究生长条件的控制和细胞死亡过程都是十分重要的。
一.试剂准备:
A. 活细胞-绿色染料(LiveDye):冰上避光放置。
B. 死细胞-红色染料(NucleiDye):冰上避光放置。
C. 实验缓冲液 (10×) [Assay Buffer(10×)]:用 ddH20 稀释 10x 实验缓冲液,至 1x 实验缓冲液(工作液)。使用前预热到 37C。
D. 染色工作液:每 1 ml 的实验缓冲液(1X)中,加入 1ul 活细胞-绿色染料(LiveDye)和 1ul 死细胞-红色染料(NucleiDye),混合均匀(适用于2个样品孔,每孔0.5ml)。如有大量样品,请成比例的扩大染色工作液配置。
二.(一)荧光显微镜:
1. 用预期的方法处理细胞,在不含诱导剂条件下孵育细胞建立阴性对照组;
2. 对于贴壁细胞,在 24 孔板的盖玻片上种植和培育细胞,在 CO2 细胞培养箱中 37°C 培养至少 24 小时。先用细胞刮刀或者胰酶-EDTA 消化细胞,之后离心收集细胞(1000 rpm,3 min)。
对于悬浮细胞,直接离心(4℃, 300g, 5 min)收集细胞。
3. 用 PBS 洗涤细胞两次,移除液体。
4. 在 24 孔板中,每个孔加入 0.5ml 染色工作液来,37℃避光孵育 15-30 min。
5. 用 PBS 洗涤细胞两次。
6. 将盖玻片覆盖到载玻片上,尽快使用适当的滤光片通过荧光显微镜分析细胞。
为了获得更佳效果,可以使用抗荧光淬灭剂对其进行观察。
(二)流式细胞分析:
1. 用预期的方法处理细胞
对于所有的处理和未处理的细胞样本,建议把未染色的对照组细胞悬浮在实验缓冲液(不含有 LiveDye 和 NucleiDye),用于流式细胞分析;
2. 对于非贴壁细胞,收集 1-5 ×105 个细胞离心 (4℃, 300g, 5 min),用预冷的 PBS 洗涤2 次,弃去 PBS。对于贴壁细胞,先用胰蛋白酶(不含 EDTA)消化细胞,然后离心去上清。
3. 用 500ul 染色工作液来悬浮细胞。
4. 避光孵育 15-30 min。
5. 使用流式细胞仪进行相应检测与分析。
关于活死细胞染色的研究,Calcein AM和碘化丙啶(PI)这两种活死细胞染色试剂盒:Calcein AM是一种疏水化合物,容易渗透完整的活细胞,进入细胞后被酯酶水解产生强烈荧光,同时它能完整的保存在细胞细胞质中,酯酶活性与活细胞的数量成正比。对于具有完整膜的活细胞,DNA染料PI是J性的无法渗透细胞膜,它仅能结合死细胞的DNA
首先我们从细胞毒性检测的原理说起,细胞毒性实验又可以被称为细胞活性检测实验,常见的检测方法有MTT法和CCK-8法。其中MTT的检测原理是活细胞中的线粒体中的琥珀酸脱氢酶将外源性MTT还原成水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中,用DMSO溶解甲臜,通过比色法间接反应活细胞数量;CCK-8法与之类似,CCK-8试剂中的WST-8可以被线粒体中的脱氢酶还原成水溶性的黄色甲臜,通过比色法反应活细胞数量。看了这两种检测方法的原理,有什么感想?是不是觉得很类似?没错,这两种方法都是通过检测线粒体代谢产物浓度间接反应细胞活性或者数量。 由于这两种方法都是通过检测线粒体代谢产物浓度来反映细胞的活性或者数量,而根据样品的作用类型,可将样品的影响分为3类:促进线粒体代谢、无影响、抑制线粒体代谢。
其中促进线粒体代谢,不一定会促进细胞增殖;抑制线粒体代谢也不一定会杀死细胞。因此单独的细胞毒性结果说明不了任何问题,只能根据结果得出一下猜想:细胞活性发生变化,有可能是细胞的代谢强度发生了变化,也有可能是细胞的数量发生了变化。具体是什么,需要进一步进行研究。细胞死活染色实验是其中一个简单的确认实验,利用活死细胞染色试剂盒,可以非常清晰的观察到细胞的生存状态。那么活死细胞染色试剂盒的原理是什么呢?常用的试剂盒一般都是Calcein-AM(无荧光)和PI的组合,其中Calcein-AM中的AM基团主要增加疏水性,以便其穿过活细胞细胞膜,当其进入到细胞质后,酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内,发出强绿色荧光。只有活细胞可以将Calcein-AM水解,因此Calcein-AM作为活细胞指示剂;而PI只能穿过死细胞的细胞膜,因此作为死细胞指示剂。细胞死活染色实验其实反映了四个方面的信息,分别是:死活细胞比例、细胞数量、活细胞形态以及死活细胞荧光强度。
作为初学者,通常只关注死活细胞比例,而忽视其他两方面的信息,因此容易产生文章开头的困惑。其实细胞毒性实验显示有细胞毒性,有可能细胞并没有凋亡,而只是代谢受到抑制,因此细胞状态不好,反映到死活染色实验中,可能表现为细胞形态发生改变,或者活细胞荧光强度发生变化;也有可能是细胞已经凋亡,并且已经从培养瓶壁上脱落,导致细胞数量减少。从上面的解释中可以看出,细胞毒性实验和细胞死活染色实验是互为补充的,在做实验的过程中,我们不必只从死活细胞的比例这一个方面对两个实验的结果进行分析,也可以尝试从其他方面进行解释。