白光和荧光的区别就在于显色方式不同,一个是荧光显色,一个是化学显色。白光TUNEL是通过亲和素-生物素系统将Streptavidin-HRP和Biotin-dUTP二者连接,最后用DAB作为HRP的底物,生成棕色沉淀,进而通过光镜观察到。
TUNEL染色是检测细胞凋亡染色的常见方法
原理:基因组DNA断裂时,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素标记的脱氧尿苷三磷酸,从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测。
TUNEL染色操作注意事项
一、组织固定注意
1、固定液最好使用4%的PBS进行固定,不建议选用乙醇和甲醇,也不能用甲醛替代。市面上大多数甲醛含有甲醇,会使后续的染色过程标记效率降低,难以观察到荧光。
2、固定液浓度不可过高。固定液浓度过高会使组织边缘迅速固定,影响液体的穿透,影响固定效果,导致组织中心的细胞自溶、DNA链不规则断裂等情况的发生,使结果假阳。
3、固定时间不可过长,太长的固定时间会影响试剂的染色效率。
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二、脱蜡水化注意
脱蜡:
1、脱蜡可以先60℃ 20 min;
水化:
水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗,这些以便后面的结合反应充分、均匀。
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三、检测孵育注意
1、一般根据切片的厚薄,选择蛋白酶k的孵育时间,常为十到三十分钟。
2、几 um切片用短时间,几十um切片用长时间,通过摸索达到既不脱片,又能够使后面的酶和抗体进入胞内。
3、实验结果出现的假阳性也可能与TUNEL染色孵育步骤有关,TUNEL染色液孵育时间过长,可能会出现非特异性荧光。
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四、检测操作注意
1、荧光在普通光照下不能长时间保持荧光,在进行需要避光操作的步骤时,我们要严格进行避光操作,避免荧光淬灭导致不能对实验结果有准确判断。
2、贴壁细胞在加药诱导凋亡后,细胞状态会发生改变,细胞形态皱缩边缘,其贴壁粘附力降低。在对此细胞进行实验染色时,需要小心操作,避免吹打造成细胞脱落,尤其是我们在对细胞的多次洗涤时操作更要小心轻柔。
TUNEL染色常见问题
一、荧光信号弱或没有荧光信号
1、样本处理不当
原因:(1)样本切片太厚。
建议:适当将切片切薄一点,便于染色。
原因:(2)脱蜡和水化不充分。
建议:脱蜡先60 ℃ 20 min,再使用二甲苯两次5-10 min。
原因:(3)Proteinase K的孵育时间过短。
建议:优化Proteinase K的孵育时间,4um左右的片子孵育10 min,30um左右的片子孵育30 min。
原因:(4)Proteinase K浓度过低。
建议:蛋白酶K一般工作液浓度为20 ug/mL。
原因:(5)放置在-20℃保存较长时间的切片不新鲜,减低染色效率。
建议:使用新鲜切片。
2、染色操作不当
原因:(1)染色时间过短。
建议:一般37 °C孵育60min,可以根据凋亡损伤程度,可长至2h,但要结合背景着色。
原因:(2) TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度过低。
建议:适当提高TdT酶或荧光素/酶标记的dUTP浓度。
原因:(3)TdT酶失活。
建议:TUNEL反应液临用前配制,短时间在冰上保存。不宜长期保存,长期保存会导致TdT酶失活。
原因:(4)样本干燥。
建议:加上TUNEL反应液后,请盖上盖玻片/保鲜膜/湿盒中进行,保证样本均匀染色,又可防止反应液干燥。
二、非特异性染色(假阳性高)
1、样本处理不当
原因:(1)使用酸性或碱性固定液,导致DNA损伤。
建议:使用pH中性的固定液固定组织或者细胞。
原因:(2)固定液浓度过高,导致细胞自溶、DNA链不规则断裂。
建议:使用4%多聚(溶于PBS) 。
原因:(3)固定时间过长,导致细胞自溶、DNA链不规则断裂。
建议:控制固定时间在4℃放置25 min。
原因:(4)蛋白酶K处理时间过长,破坏核酸结构,出现假阳性。
建议:适当缩短处理时间。
原因:(5)蛋白酶K浓度过大,破坏核酸结构,出现假阳性。
建议:适当调整蛋白酶K溶液浓度,一般工作液浓度为20ug/ml。
2、染色操作不当
原因:(1)TUNEL染色时间过长
建议:一般是37 ℃孵育60 min,可以根据凋亡损伤程度,可长至2h,但要结合背景着色。
原因:(2)未充分清洗样本。
建议:染色后PBS清洗次数可增加到5次,来避免切片的非特异性染色。
三、荧光背景强
1、样本操作不当
原因:(1)TUNEL染色时间过长。
建议:染色时间适当,一般是 37℃孵育60 min,避免串色。
原因:(2)TUNEL染色液浓度过大。
建议:增大稀释倍数,优化浓度。
原因:(3) PBS未充分清洗样本。
建议: TUNEL反应后增加PBS清洗次数,避免切片样本残留染料。
2、荧光检测操作不当。正确处理如下:
曝光时间过长。建议调整曝光条件,先对阴性组调整到无背景光,然后用这个曝光条件去拍摄实验组(可以微调,但是不需要大调)。