脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)活性检测试剂盒 可见分光光度法

脱氢抗坏血
酸还原酶（DHAR）活性检测试剂盒说明书
 可见分光光度法                                                 
货号: BC0660
规格: 50T/24S
产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

试剂名称	规格	保存条件
提取液	液体60 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂一	液体30 mL×1瓶	2-8℃保存
试剂二	粉剂×1瓶	-20℃保存
试剂三	粉剂×1瓶	2-8℃保存
试剂四	液体10 mL×1瓶	2-8℃保存
标准品	粉剂×1支	2-8℃保存

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入3 mL蒸馏水充分溶解，用不完的试剂-20℃分装保存2周。
2. 试剂三：粉剂置于试剂瓶内EP管中。临用前加入3.5 mL蒸馏水充分溶解，2-8℃保存。
3. 标准品：临用前加入1 mL蒸馏水，配制成10mg/mL的标准溶液。

产品说明：
脱氢抗坏血酸还原酶（Dehydroascorbate reductase，DHAR）是植物体内一种重要的抗氧化酶，是抗坏血酸-谷胱甘肽氧化循环中促进抗坏血酸再生的关键酶。DHAR在循环中利用抗坏血酸维持植物体内抗坏血酸的正常代谢水平，保护细胞组分抵御氧化损伤方面发挥着重要作用。
DHAR催化还原型谷胱甘肽（GSH）还原脱氢抗坏血酸（DHA）生成AsA，GSH能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基 苯甲酸）（DTNB）反应产生2-硝基-5-*甲酸（TNB）和谷胱甘肽二硫化物（*）。TNB在波长412nm处具有最大光吸收。通过测定GSH的减少速率，计算DHAR活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
研钵/匀浆器、冰、低温离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、水浴锅、可调式移液器和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按照组织质量（g）:提取液体积（mL）1：5-10的比例（建议称取约0.1 g组织，加提取液1 mL），冰上充分研磨匀浆，8000g，4℃，离心10 min，取上清液置于冰上待测。
2. 细菌、细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500-1000：1的比例（建议500万细胞加入1 mL提取液），冰浴超声破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔7s，总时间3 min）；然后8000g，4℃，离心10 min，
取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接检测。

二、测定步骤

1. 分光光度计预热30min，调节波长到412nm，蒸馏水调零。
2. 标准溶液的配制：将10mg/mL标准液用蒸馏水稀释为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL的标准溶液备用。
3. 加样表

试剂名称(μL)	测定管	对照管	空白管	空白对照管	标准管	标准空白管
样本	50	50	-	-	-	-
标准溶液	-	-	-	-	50
蒸馏水	-	-	-	-	-	50
试剂一	250	350	300	400	350	350
试剂二	50	-	50	-	-	-
试剂三	50	-	50	-	-	-
试剂四	100	100	100	100	100	100
蒸馏水	500	500	500	500	500	500
混匀，25℃放置20min后测定各管412nm处吸光度，分别记为A测定管和A对照管、A空白管、A空白对照管、A标准管及A标准空白管。ΔA=（A空白管-A空白对照管）-（A测定管-A对照管），ΔA标准=A标准管-A标准空白管。（空白管、空白对照管、标准管及标准空白管只需检测1-2次）

三、DHAR活性计算

1. 标准曲线的绘制：以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA带入方程得到x（mg/mL）。
2. DHAR活性的计算：

（1）按蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化1μg GSH氧化为1个酶活力单位。
DHAR活性(U/mg prot) = x×V提取÷（V提取×Cpr）×10³÷T=50x÷Cpr
（2）按样本质量计算
酶活定义：每克样本每分钟催化1μg GSH 氧化为1个酶活力单位。
DHAR活性(U/g 质量) = x×V提取÷W×10³÷T =50x÷W
（3）按细胞数量计算
酶活定义：每10⁴个细胞（细菌）每分钟催化1μg GSH氧化为1个酶活力单位。
DHAR活性(U/10⁴ cell) = x×V提取÷细胞数量（万个）×10³÷W÷T =50x÷细胞数量（万个）
（4）按血清等液体计算
酶活定义：每mL样本每分钟催化1μg GSH氧化为1个酶活力单位。
DHAR活性（U/mL）= x×V样÷V样×10³÷T = 50x
V提取：提取液体积，1 mL；10³：单位换算系数，1mg = 10³ µg；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：20min；V样：加入样本体积，0.05mL。

实验实例：

1. 取0.1g商陆加入1mL提取液冰上充分研磨匀浆，8000 g，4℃离心10 min，取上清液置于冰上，按照测定步骤操作，测得计算ΔA=（A空白管-A空白对照管）-（A测定管-A对照管）=（0.905-0.045）-（0.896-0.292）=0.256，标准曲线y=2.153x+0.0089，依据标准曲线计算x=0.1148mg/mL，按样本质量计算酶活得：DHAR活性(U/g 质量) =50x÷W=57.4 U/g 质量。

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BC0650/BC0655  单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性检测试剂盒
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