总 RNA 柱式提取试剂盒

总RNA柱式提取试剂盒

产品描述

本试剂盒可以快速从细胞、细菌和部分动物组织中提取高质量的总RNA，不使用酚和氯仿等有毒物质。试剂盒中裂解液（Lysis Buffer）含有强变性剂和RNA酶抑制剂，能够迅速裂解样品并失活RNA酶，确保操作过程中RNA的完整性。提取得到的总RNA可用于RT-PCR、qPCR、Northern blotting、cDNA文库构建等多种实验。整个提取过程仅需10 min，操作简单快速、稳定性高。

本试剂盒仅适用于部分组织类型，包括肝脏、肠、脑、脾脏和柔软的肿瘤组织，不适用于肺、心脏、皮肤、骨骼、肌肉等坚韧的组织。

订购信息

产品组分

u  Wash Buffer使用前请加入48ml无水乙醇，摇匀后使用。

运输与保存

常温运输。常温保存，有效期12个月。

使用方法

一、 样品裂解

1.       贴壁培养的细胞

(1)       移除培养基，PBS洗一次；

(2)       在培养板中加入500 μL的Lysis Buffer (＜3x10⁶个细胞)，水平放置片刻，再用枪头吹吸或搅拌数次，直至细胞完全裂解。转移至1.5mL离心管中，用力反复吹打数次，充分裂解直到看不到细胞团为止，然后进行步骤二；

注：(1) 细胞样品建议用6孔板或35mm培养皿培养细胞，培养至合适的密度进行 RNA提取 (24孔板培养的细胞培养至90%以上的细胞密度也可使用)。 (2) 不方便直接裂解的培养容器，可以使用细胞刮刮下细胞或者胰酶消化后，将细胞收集到离心管中。 (3) 对于T细胞/B细胞等体积很小、RNA含量很低的细胞，建议增加细胞数到至少1x10⁶以上。

2.       悬浮培养的细胞

(1)       取1~3x10⁶个细胞的悬液至1.5 mL离心管，1000 g离心1 min收集细胞；

(2)       去上清，加入500 μL的Lysis Buffer，用力吹吸10次，vortex 10 s，保证细胞完全裂解，看不到细胞团，然后进行步骤二。

3.       细菌细胞

5,000 rpm离心3 min收集适量的菌体(＜5x10⁸)，弃去上清，加入100μL含有溶菌酶的TE buffer，吹打混匀，室温静置孵育数分钟。加入500 μL的Lysis Buffer，剧烈振荡20 s，12,000rpm离心1~2 min，取上清，然后进行步骤二。

4.       动物组织（适合肠、肝、脑、脾、肿瘤，不适用肺、心、皮肤等坚硬组织）

(1)       匀浆器匀浆：切取新鲜组织10~50mg至1.5 mL离心管中，加入500 μL的Lysis Buffer，用组织匀浆机彻底匀浆组织，直至无肉眼可见的组织块。12,000 rpm离心1~2 min。

(2)       或液氮研磨：在液氮中将10~50mg组织充分研磨，将研磨成粉的样品转移至离心管中，加入加入500 μL的Lysis Buffer，剧烈振荡20 s，12,000rpm离心1~2 min。

(3)       转移不超过400μL上清至新离心管中。

二、RNA提取

1.       细胞样品

较精确估计裂解液体积，向细胞裂解液中加入等体积的无水乙醇，将离心管剧烈颠倒几次，或用移液器用力吹吸数次，充分混匀，然后将液体转移至离心柱上，进行步骤3。注：可能会产生沉淀,这是正常现象，不影响提取过程，继续后续操作。

2.       组织样本

较精确估计裂解液体积，向裂解液中加入0.5倍体积的无水乙醇（或等体积的70%乙醇），将离心管剧烈颠倒几次，或用移液器用力吹吸数次，充分混匀，然后将液体转移至离心柱上。

3.       7,000 rpm离心1 min（如离心柱上仍有液体残留可增加转速至12,000 rpm）,弃废液。

4.       向RNA柱中加入500 μL的Wash Buffer，12,000 rpm离心1 min。

5.       倒掉废液，将RNA柱装回收集管，12,000 rpm空管离心1 min，完全去除残留的Wash Buffer。

6.       取出RNA吸附柱，放入一个RNase-free的1.5mL离心管中，开盖晾干1 min。向RNA柱的膜中心部位加入25~50uL的Elution buffer，室温静置1 min。

7.       12,000 rpm离心1 min。样品可长期保存至-80℃。注：加洗脱液体积不应少于25uL，否则会影响回收率，为了获得更大浓度的RNA，可将离心的RNA溶液重新加入到吸附柱，重复洗脱一遍。

注意事项

1.     本产品仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。

2.     加入Lysis Buffer后，一定要充分振荡，保证RNA提取的效果；如果混合液非常粘稠难以转移，明显样品量过多，增加Lysis buffer用量或减少样本用量。

3.     细胞或组织裂解产物，上柱前需要加入无水乙醇，充分混匀之后加入离心柱离心。

4.     使用的样本避免反复冻融，以免影响RNA的产率和质量。

5.     关于RNA纯度：OD260/OD280和OD260/OD230比值是衡量RNA纯度的指标, 高质量的RNA，OD260/OD280的值在1.9-2.2之间，OD260/OD230大于1.8（比较纯净的比值大于2.0）。本试剂盒提取RNA,使用Nanodrop等微量分光光度计测定OD 260/280在1.90~2.2之间，OD260/230在2.0~2.2之间均属正常。

6.     关于DNA微量残留：在总RNA提取过程中，通常无法完全避免基因组DNA的微量残留。使用本试剂盒，由于结合了独特的缓冲液体系和高特异性吸附膜，获得的总RNA中DNA残留量较少，对大多数qPCR扩增过程影响不大。如果实验对基因组DNA残留较为敏感，建议采取以下措施：①DNase I 处理：在后续步骤中使用DNase I 酶消化基因组DNA。②优化引物设计：选择跨内含子的引物或设计在基因组DNA和cDNA上扩增产物大小不同的引物对，以避免DNA作为模板参与扩增反应。