Exonuclease III

PCR反应条件优化：
1、变性温度和时间：
Exonuclease III保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。

 描述： 核酸外切酶 III 来源于 E.coli，具有 3′-5′外切酶活性，它作用于双链 DNA，从 3′ OH 末端方向逐步切去单核苷酸；每次酶与底物结合催化，只有几个核苷酸被除掉，从而在 DNA 分子群内产生渐进缺失。该酶的最佳底物为平末端、5′突出末端双链 DNA 分子，但也可作用于双链 DNA 的缺刻处，从 3′降解 DNA 分子，释放 5′单核苷酸。对于 3′突出末端，尤其是多于 4nt 的几乎完全不切割, 亦不能切割硫代磷酰脂键。核酸外切酶 III 的活性部分依赖螺旋结构，并根据序列的不同 而有差异（C＞A=T＞G）。另外，核酸外切酶 III 还具有脱嘌呤/嘧啶-核酸内切酶活性、RnaseH 活性和 3′磷酸酶活性。

活性定义：50 μl 反应体系中，37℃ 条件下，30 分钟
催化 E.coli DNA 产生 1 nmol 酸可溶性产物所需要的量定义为一个活性单位。
应用： 非定向巢式缺失定点突变链特异性探针的制备
制备用于双脱氧测序的单链底模板
热失活：70°C，20min。
1X Exonuclease III Buffer: 10 mM Bis-Tris（pH 7.0），10
mM MgCl2，1 mM DTT。
酶储存液：50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM KCl, 1 mM
DTT, 25% Glycerol.
储存：置于-20°C 可保存 2 年，避免反复冻融。

 

货号	产品名称	规格
XG-P3073	Exonuclease III	5000U

降落PCR与温度梯度PCR的区别：
降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。
温度梯度PCR是为了找到最适的退火温度，设置不同的退火温度进行多管PCR，将其分别放置在PCR仪中的不同温度模块进行反应，最终找到最适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。
降落PCR是为了提高反应的特异性，通过设计一系列不断降低的退火温度，在同一PCR管内进行PCR扩增，最终获得大量的特异性扩增产物。
与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势。温度梯度PCR需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度，之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR，才能得到较好的扩增效果，操作比较繁琐。降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。
降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值，或引物扩增效果不佳时，不了解目的模板同源性程度，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
 

PCR的特点：
特异性强：使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。
灵敏度高：进行两轮PCR扩增，可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制，提高PCR的灵敏度。

 
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