预染发光Western Marker

 描述：

传统的 Western Blot 试验需要使用预染蛋白 Marker 来跟踪检测阳性抗原信号和转膜效率，但预染蛋白 Marker 无法在胶片上曝光，曝光信号需要根据膜上的预染蛋白 Marker来判断。全新研发的Prestained & Western Blot Marker是专门为 Western Blot 试验设计的分子量标准，由 9 种发光蛋白和 9 种预染蛋白组成；9 中发光蛋白分别为 23、30、36、44、50、62、90、120 和 160KDa，这些蛋白均可与抗体结合, 因此能与抗原在同一张膜上曝出信号，阳性信号可以直接通过 Western Marker 的位置来判断；9 种预染蛋白分别为 15、25、35、40、55、70、100、130 和 180KDa，其中 70KDa为红色，其他为蓝色，转膜完毕后在膜上肉眼可见。主要特征
可与抗原同时检测信号，使 Western blot 结果判断更加简便发光 marker 没有偶联和标记其他分子，分子量更加准确综合发光 marker 和预染 marker 的优势，既能监测转膜又能与抗原同时检测

货号	产品名称	规格
XG-P3051	预染发光Western Marker	100μl
XG-P3051	预染发光Western Marker	500μl

储存：-20°C 保存，有效期 2 年。
使用方法
待 Prestained & Western Blot Marker 至室温完全融化后，取 2~10 μl（通常 5μl）至上样孔中，进行 SDS-PAGE 电泳；电泳完毕后转至 PVDF 膜或 NC 膜，与一抗二抗孵育；孵育完毕后，将本品与抗原一起通过 ECL 曝光至胶片或荧光显色。
注意事项：
1. 本产品可直接使用，不需要加热。
2. 可根据抗体的效价或曝光时间的长短调整 Prestained & Western Blot Marker 的上样量。
3. 使用新配制的凝胶，及时更换电泳缓冲液和转膜液，以免影响实验结果。

  PCR反应条件优化：
1、变性温度和时间：
预染发光Western Marker保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90~95°C, 30~60s，再复杂的DNA 分子也可变性为单链。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。
2、复性温度和时间:
PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度越高，产物特异性越高。复性温度越低，产物特异性越低。需根据引物的Tm值具体设定。
3、延伸温度和时间:
一般位于Taq酶最适作用温度70~75°C之间。引物小于16个核苷酸时，过高的延伸温度不利于引物与模板的结合，可以缓慢升温到70~75°C。延伸反应时间，可根据待扩增片段的长度而定，小于1kb, 1min足够；大于1kb需加长延伸时间。Taq酶可根据1kb/min增加时间。这里需要注意，延伸时间过长可能出现非特异扩增。因此需要设置恰到好处的延伸时间。
4、循环数:
其他参数选定后，PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。理论上说20〜25次循环后，PCR产物的积累即可达到最大值，实际操作中由于每步反应的产率不可能达到100%，因此不管模板浓度是多少，20~30次是比较合理的循环次数。循环次数越多，非特异扩增增加。
 

PCR的特点：
特异性强：使用两对引物进行扩增提高了特异性，第一轮PCR中由外引物错配产生非特异性产物，同时在第二轮PCR中内引物与错误片段配对扩增的概率极低，降低了扩增多个靶位点的可能性。
灵敏度高：进行两轮PCR扩增，可以执行更多的循环，从低拷贝样本中扩增得到足量的产物，克服了单次扩增平台期限制，提高PCR的灵敏度。

 
降落PCR与温度梯度PCR的区别：
降落PCR与温度梯度PCR都是对反应体系中的退火温度进行优化，但两者在原理上有所不同。
温度梯度PCR是为了找到最适的退火温度，设置不同的退火温度进行多管PCR，将其分别放置在PCR仪中的不同温度模块进行反应，最终找到最适的退火温度，并进一步以此退火温度进行普通PCR扩增。
降落PCR是为了提高反应的特异性，通过设计一系列不断降低的退火温度，在同一PCR管内进行PCR扩增，最终获得大量的特异性扩增产物。
与温度梯度PCR相比，降落PCR更有优势。温度梯度PCR需要多次反应或多管反应找到最适的退火温度，之后还需以找到的最适退火温度再次进行PCR，才能得到较好的扩增效果，操作比较繁琐。降落PCR只需一次反应就可以获得很好的扩增效果，避免了对每对引物进行最适退火温度的优化和测定工作。
降落PCR适用于不确定引物的最适Tm值，或引物扩增效果不佳时，不了解目的模板同源性程度，使用降落PCR可以快速、特异的得到目的扩增片段。根据不同实验的需要，降落PCR还可与其它PCR方法同时使用，如实时定量降落PCR、竞争降落PCR等。
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