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pPIC9K Seamless
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48
12 个月
上海西格
2-8°C
20 μl
保存条件:-20℃保存
产品介绍:pPIC9K为毕赤酵母表达载体,载体能够使用的毕赤酵母宿主菌。 pPIC9载体大小9276 bp,是融合表达载体,利用alpha因子分泌信号肽,分泌表达蛋白基因。在毕赤酵母中利用HIS4进行筛选。在载体构建过程中,目的基因必须保证与信号肽的起始密码子的读码框一致。本产品提供pPIC9K经EcoRⅠ酶切后的线性化载体,可用无缝克隆技术将单个或多个DNA片段组装到载体上。无缝克隆技术可在重组酶的作用下,只需一步反应,便可将片段克隆到任何载体中的任意位置,得到重组质粒。无缝克隆技术作为一种非常强大的克隆技术,具有快速、简便、高效、多片段组装和定向克隆等特点,用于单个DNA片段的克隆,多个DNA片段组装克隆以及多位点突变构建等实验目的。产品特点:1. pPIC9K为毕赤酵母表达载体,载体能够使用的毕赤酵母宿主菌。2. pPIC9载体利用alpha因子分泌信号肽,分泌表达蛋白基因。3. 在毕赤酵母中利用HIS4进行筛选。4. 无缝克隆技术只需要简单的 PCR 扩增就可以制备片段DNA。5. 可以克隆长片段和多片段DNA。操作步骤:1. pPIC9K线性化载体使用方法:(1) pPIC9K线性化载体当做克隆载体使用,可以在扩增PCR产物的上游引物 5’端添加序列:GAGAGGCTGAAGCTTACGTAGAATTC下游引物 5’端添加序列:GCGAATTAATTCGCGGCCGC通过无缝克隆连接到pPIC9K中。(2) 测序引物AOX1-F:GACTGGTTCCAATTGACAAGC或alpha-Factor-F:TACTATTGCCAGCATTGCTGCAOX1-R:GCAAATGGCATTCTGACATCC(3) pPIC9K线性化载体为 EcoRⅠ酶切后的线性化载体,图谱及多克隆位点见下图。PCR反应基本步骤:一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成,每个循环包括以下3个步骤:变性(Denaturation):利用高温(93-98℃)使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟,接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。退火或称接合,复性(Annealling):在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。延伸(Extension):DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。PCR 反应需要使用哪些试剂?一、模板DNA:PCR反应需要模板DNA,如从细胞、组织、血液中提取DNA等;二、引物:PCR反应的两个引物,分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域,引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物;三、dNTPs:PCR反应中需要四种dNTPs,包括脱氧腺苷酸(dATP)、脱氧胸苷酸(dCTP)、脱氧鸟苷酸(dGTP)、脱氧胞嘧啶酸(dTTP),用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程,用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增;四、Taq DNA聚合酶:PCR反应需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等,用于扩增DNA链;五、PCR buffer溶液:对PCR反应具有缓冲作用,调节反应pH,硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛,可增强PCR反应特异性,从而提高反应效率;六、酶切体系:PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤,常常需要进行酶切操作。七、MARK:一种分子量标准,用来判别DNA片段大小的工具。八、DNA纯化试剂盒:用于纯化PCR反应产物;
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