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pBM21快速克隆试剂盒(克隆
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上海西格
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保存条件:-20℃保存产品介绍:pBM21快速克隆试剂盒为一种阳性选择克隆系统,克隆区域位于pBM21质粒的自杀基因(lethal gene)内部。当连接产物转化大肠杆菌后,有外源片段的插入的重组质粒导致载体上的自杀基因功能丧失,细菌存活,无片段连接(载体自连)时,自杀基因表达的毒蛋白使细菌不能存活。该试剂盒利用T4 DNA 连接酶(T4 DNA ligase)的连接活性将平末端DNA片段克隆到具有磷酸化末端的线性化载体pBM21中。适用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物或各种方法产生的平末端双链DNA片段。由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶扩增的非平末端PCR产物,可通过平末端化酶(Blunting Enzyme)处理成为平末端DNA用于连接。阳性克隆可以用试剂盒提供的引物PBM21F和PBM21R进行菌落PCR或测序鉴定。产品特点:(1)连接反应仅需5-30分钟。(2)适用于平末端PCR产物和平末端双链DNA片段(3)适用于磷酸化或非磷酸化的DNA片段(4)pBM21为氨苄抗性,具高拷贝复制起始子
PCR反应基本步骤:一般的聚合酶链式反应由20到35个循环组成,每个循环包括以下3个步骤:变性(Denaturation):利用高温(93-98℃)使双链DNA分离。高温将连接两条DNA链的氢键打断。在第一个循环之前,通常加热长一些时间以确保模板和引物完全分离,仅以单链形式存在。该步骤时间1-2分钟,接下来PCR仪就控制温度进入循环阶段。退火或称接合,复性(Annealling):在DNA双链分离后,降低温度使得引物可以结合于单链DNA上。此阶段的温度通常低于引物熔点5℃。错误的退火温度可能导致引物不与模板结合或者错误地结合。该步骤时间1-2分钟。延伸(Extension):DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。传统的Taq估计合成1000bp/min、较新的Tbr(来自于嗜热菌Thermus brockianus)约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。PCR 反应需要使用哪些试剂?一、模板DNA:PCR反应需要模板DNA,如从细胞、组织、血液中提取DNA等;二、引物:PCR反应的两个引物,分别与模板DNA的两端配对扩增所需的特定区域,引物也可以合成为TA克隆等过程中使用到的引物;三、dNTPs:PCR反应中需要四种dNTPs,包括脱氧腺苷酸(dATP)、脱氧胸苷酸(dCTP)、脱氧鸟苷酸(dGTP)、脱氧胞嘧啶酸(dTTP),用于细胞分裂、DNA合成等生物学过程,用于PCR扩增的模板DNA链的延伸和扩增;四、Taq DNA聚合酶:PCR反应需要的聚合酶,一般使用Taq聚合酶,还有一些其他种类的聚合酶如PFU、Phusion等,用于扩增DNA链;五、PCR buffer溶液:对PCR反应具有缓冲作用,调节反应pH,硫代硫酸氢盐SDS、小分子有机化合物如甲醛,可增强PCR反应特异性,从而提高反应效率;六、酶切体系:PCR扩增往往涉及到重组、构建和测序等等实验步骤,常常需要进行酶切操作。七、MARK:一种分子量标准,用来判别DNA片段大小的工具。八、DNA纯化试剂盒:用于纯化PCR反应产物;公司供应的相关产品:
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