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- 信帆生物
- XJC5210
- 国产
- 2025年07月14日
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信帆生物
（适于一抗来源为大鼠的抗体，可以做160张左右的切片）
【试剂组成】
| 试剂编号 | 试剂组成 | 装量 | 用途说明 | 保存条件 |
| R1 | 正常兔血清封闭液 | 12ml | 用于组织切片的封闭 | 4℃保存 有效期一年 应避免冷冻 |
| R2 | 二抗 | 12ml | 生物素化兔抗大鼠 IgG | |
| R3 | SABC | 12ml | 链酶亲和素-过氧化物酶复合物 |
SABC 是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，分子量 47000。同亲和素一样，对生物素分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。亲和素是一个碱性蛋白质（pI=10），经改造后可以转变成中性蛋白质。链霉亲和素等电点接近中性， pI=6.0~6.5，对组织和细胞的非特异吸附很低，基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。SABC 即 StreptAvidin—Biotin Complex,。根据研究，SABC 大约可形成一百个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物。大量的酶将保证 SABC 具有很高的敏感性。SABC 兼具高敏感性，低背景和操作简便的优点。
【用户自备试剂】
1、粘片剂 APES 或 POLY-L-LYSINE。
2、免疫组化专用 PBS（pH7.2-7.6）配法：1000ml 蒸馏水中加氯化钠 8.5g，Na2HPO4 2.8g，
NaH2PO4 0.4g。如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
3、0.01M 枸橼酸盐缓冲液：1000ml 蒸馏水中加枸橼酸三钠（C6H5Na3O7•2H2O）3g，枸橼
酸(C6H8O7•H2O ) 0.4g。
4、DAB 显色试剂盒。
【免疫组化染色程序的选择】
用户需根据抗原/抗体的特点确定程序，多数情况下要先比较各程序染色结果。
A 程序：石蜡切片热修复抗原程序。促进某些位于蛋白质内部的位点暴露。
B 程序：石蜡切片酶消化程序。促进某些被固定遮避的抗原位点暴露。
C 程序：石蜡切片不消化/不修复程序。适于稳定的抗原。
D 程序：细胞涂片，冰冻切片染色程序。
A、石蜡切片热修复抗原染色程序：
1、载玻片防脱片剂处理：可选择APES 或Poly-Lysine。捞片后置烤箱58-60℃ 30-60 分以使切片紧密粘附。
2、切片常规脱蜡至水。
3、30%H2O2 1份 + 蒸馏水10 份混合，室温5-10 分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3 次。
4、热修复抗原:将切片浸入0.01M 枸橼酸盐缓冲液（PH6.0），电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10 分钟后，反复1-2 次。冷却后PBS（pH7.2-7.6）洗涤1-2 次。
5、滴加5%BSA 封闭液,室温20 分钟。甩去多余液体, 不洗。
6、滴加适当稀释的一抗（大鼠IgG），37℃ 1 小时左右或20℃时2 小时左右。也可4℃过夜。PBS（pH7.2-7.6）洗2 分钟×3 次。（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。）
7、滴加生物素化兔抗大鼠IgG，37℃ 20 分钟。PBS（pH7.2-7.6）洗2分钟×3 次。
8、滴加试剂SABC，20-37℃ 20 分钟。PBS（pH7.2-7.6）洗5 分钟×4 次。
9、DAB 显色：使用DAB 显色试剂盒（货号：I025）。取1ml 蒸馏水，加试剂盒中A、B、C 试剂各1 滴，混匀后加至切片。室温显色, 镜下控制反应时间，一般在5-30 分钟之间。也可自配显色剂显色。蒸馏水洗涤。
10、苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。
B、石蜡切片酶消化程序：
以下面的步骤代替A 程序中的第4 步：滴加复合消化液（南京建成有售）5-10 分钟。蒸馏水洗3 次。也可以使用0.1%的胰蛋白酶作消化液。
C、石蜡切片不消化/不修复程序：
对于不需要微波修复或消化的抗原,省略A 程序中的第4 步即可。
D、血涂片，细胞和冰冻切片染色程序：
1、载玻片经防脱片剂处理（Poly-L-Lysine）。抗凝血经分层离心后涂片；培养细胞也可涂片或贴片生长；冰冻切片室温风扇吹干。
2、固定方案4%多-聚-甲-醛或10%福尔马林固定30分钟。
3、30%H2O2 1 份+纯甲醇50 份混合,室温浸泡30 分钟，以灭活内源性过氧化物酶。蒸馏水洗1-2 次。其余步骤和石蜡切片5-10 步相同。如果冰冻切片直接染色结果不理想时,可以参照石蜡切片对切片进行热修复，方法和石蜡切片4-10 步相同。
即用型SABC-POD 免疫组化试剂盒
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文献和实验度合适(按说明书推荐的稀释度或预实验摸索)的生物素标记二抗于切片上，室温孵育1小时，继而PBS漂洗3次，每次5分钟。二抗有抗鼠、抗兔和抗羊等之分，特异性要与一抗匹配，否则，一抗和二抗连接有误可导致假阴性染色结果。例如，兔抗鼠或人的一抗需与抗兔的二抗匹配，小鼠抗大鼠或人的一抗需与抗小鼠的二抗匹配。目前，生物素化二抗多以即用型形式存在于SABC或SP免疫组织化学试剂盒中，故无需考虑其浓度。 9．SABC-POD或SABC-AP孵育 滴加稀释度合适(按说明书推荐的稀释度或预实验摸索)的ABC
和抗羊等之分，特异性要与一抗匹配，否则，一抗和二抗连接有误可导致假阴性染色结果。例如，兔抗鼠或人的一抗需与抗兔的二抗匹配，小鼠抗大鼠或人的一抗需与抗小鼠的二抗匹配。目前，生物素化二抗多以即用型形式存在于SABC或SP免疫组织化学试剂盒中，故无需考虑其浓度。 9.SABC-POD或SABC-AP孵育 滴加稀释度合适(按说明书推荐的稀释度或预实验摸索)的ABC-POD或SABC-AP于切片上，室温孵育10~30分钟，随后PBS漂洗4次，每次5分钟。SABC或SP试剂盒中的即用型
与其他免疫组化染色基本相似，有良好的可操作性。尽管SABC法操作简便，敏感性强，但是，在操作中仍然要遵循一定的原则，才能得到可信度高的结果。我所做的是《……》（题目略去，是2003年获国家自然科学基金专项基金项目，批准号：302400**）的动物实验部分。其中，需要利用抗β1-integrin观察深Ⅱ度烫伤大鼠局部在微电流治疗后β1-integrin的分布情况。应用的方法就是SABC法，试剂盒（即用型）来自博士德公司（不是为该公司做广告）。下面就按照实验步骤，谈一下我的一些体会。1、载玻片防脱片剂处理
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