BeyoFast™ SYBR Green One-Step

碧云天的BeyoFast™ SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (防污染型)，即BeyoFast™ SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (UDG)，是一种基于SYBR Green染料用于一步法反转录实时荧光定量PCR，即qRT-PCR (Quantitative Reverse Transcription PCR)或real-time RT-PCR的新型高品质防污染(Carryover prevention)预混液试剂盒，主要用于RNA的特异性超高灵敏度定量检测。本产品含有优化比例的高品质UDG酶和dUTP，可有效消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题造成的假阳性或CT值偏低。SYBR Green法一般也称染料法，所以本方法也常称作防污染型染料法。

UDG (Uracil-DNA Glycosylase)，也称UNG (Uracil-N-glycosylase)，可催化含尿嘧啶的DNA链中的尿嘧啶(dU)碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键发生水解，从而释放游离尿嘧啶，主要应用于消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题。其防止污染的原理为：在PCR反应中加入适量的dUTP，以dUTP替代dTTP掺入DNA中，形成含dU碱基的PCR扩增产物；后续进行PCR反应时，使用UDG酶选择性切割可能被污染而带入的之前PCR扩增产生的含有dU的单链或双链DNA，从而避免之前的PCR扩增产物可能的污染对于本次PCR扩增带来的负面影响。

BeyoFast™ SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (防污染型)以提取的RNA为模版，使用qPCR引物在同一反应管内连续进行反转录和荧光定量PCR，操作简单快速，最大限度地减少人为误差，有效降低污染风险，节约PCR实验的操作时间，检测通量大。

本产品整合了高效的BeyoRT™ M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor和优异的抗体结合型热启动BeyoFast™ Taq DNA Polymerase，并优化了缓冲体系，反转录性能优、检测灵敏度高、扩增特异性强、反应稳定性好，非常适合于內源低丰度RNA、外源病毒RNA等微量RNA的检测。

BeyoFast™ SYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (防污染型)使用SYBR Green I作为染料。SYBR Green I是一种结合于双链DNA(double-strand DNA, dsDNA)双螺旋小沟区域的绿色荧光染料。SYBR Green I在游离状态下的荧光比较微弱，一旦与双链DNA结合后，其荧光会大大增强。这样通过检测荧光强弱就可以定量检测PCR过程中扩增产生的双链DNA的数量。

本产品使用的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase是一种与抗体结合的高品质热启动酶，能够实现便捷高效的热启动。BeyoFast™ Taq DNA Polymerase中的Taq酶与抗Taq酶的单克隆抗体相互结合，从而抑制了Taq酶的DNA聚合酶活性，这样可以有效避免在低温条件下由引物和模板DNA非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增。在PCR反应的预变性步骤中抗体会被加热失活，这样可以确保仅在预变性后才会把Taq酶的活性释放出来，预变性之前不会发生DNA聚合反应，从而大大提高了PCR反应的特异性、灵敏度和定量检测的准确性。

本产品包含了BeyoRT™ M-MuLV Reverse Transcriptase、BeyoFast™ Taq DNA Polymerase、UDG酶、PCR Buffer、dNTPs、dUTP、SYBR Green I荧光染料、稳定剂、Nuclease-free Water、ROX (根据不同荧光定量PCR仪进行选择)和镁离子等所有的通用组分，使操作更简单、使用更便捷。用户只需自备引物和样品RNA即可。

本产品提供了Low ROX和High ROX，广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动，从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起，如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器在配制反应体系时选择高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不加ROX。常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。

添加ROX类型	适用PCR仪
不需添加	Bio-Rad: CFX384, CFX96, MiniOpticon, iCycler IQ, MyiQ and iQ5; Eppendorf: Mastercycler ep realplex and realplex2 s; Qiagen/Corbett Rotor-Gene: 6000; Roche LightCycler 480; Cepheid SmartCycler; Illumina: Eco qPCR
Low ROX	ABI: 7500(Fast), ViiA 7, QuantStudio 6 and 7 Flex Systems; Stratagene: Mx3000P, Mx3005P and Mx4000; Qiagen/Corbett Rotor-Gene: 3000; Bio-Rad/MJ: Chromo4, Opticon 2 and Opticon
High ROX	ABI GeneAmp 5700; ABI PRISM 7000, 7700; ABI 7300, 7900HT(Fast); ABI StepOne(Plus)

如果用于常规的96孔板qRT-PCR检测(建议反应体系为20µl)，本产品小包装D7509S可以进行100次检测，中包装D7509M可进行500次检测；如果用于常规的384孔板qRT-PCR检测(建议反应体系为10µl)，本产品小包装D7509S可以进行200次检测，中包装D7509M可进行1000次检测。

包装清单：

产品编号	产品名称	包装
D7509S-1	SYBR Green One-Step Enzyme Mix (20X, UDG)	100µl
D7509S-2	SYBR Green One-Step Reaction Buffer (2X)	1ml
D7509S-3	Nuclease-free Water	1ml
D7509S-4	Low ROX (50X)	40µl
D7509S-5	High ROX (50X)	40µl
—	说明书	1份

 

产品编号	产品名称	包装
D7509M-1	SYBR Green One-Step Enzyme Mix (20X, UDG)	0.5ml
D7509M-2	SYBR Green One-Step Reaction Buffer (2X)	5ml
D7509M-3	Nuclease-free Water	5ml
D7509M-4	Low ROX (50X)	200µl
D7509M-5	High ROX (50X)	200µl
—	说明书	1份

保存条件：

-20ºC避光保存，两年有效。尽量避免反复冻融。

注意事项：

请注意避免RNase污染，使用RNase-free的枪头、离心管等。

SYBR Green One-Step Enzyme Mix (20X, UDG)含有高浓度甘油，粘度高，使用前将短暂离心至管底，并用移液器轻轻混匀，混匀过程中尽量避免产生气泡，然后缓慢准确吸取。

使用前需确保SYBR Green One-Step Reaction Buffer (2X)完全融化，上下颠倒轻轻混匀后使用。

如果扩增片段较长或者RNA结构较为复杂，可将模板RNA在65ºC预处理5-10分钟，可提高反转录效率。

本反应使用qPCR的Reverse Primer作为反转录的基因特异性引物，不能使用Random Hexamer Primer或Oligo(dT) Primer等常用于cDNA第一链合成的引物。

注意引物退火温度，当退火温度<60ºC时，推荐使用三步法PCR扩增。

本产品中含有SYBR Green I荧光染料，保存本产品或设置PCR反应时应避免强光照射，以尽量避免荧光淬灭问题。

对于超过350bp或者高GC含量的扩增片段，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。

经测试，本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响。但仍需尽量避免反复冻融本产品，反复冻融可能使产品性能下降。

qPCR检测是超高灵敏度的检测，尽管本产品有很好的防污染效果，PCR反应设置区域还是需尽量避免各种可能的待扩增产物的污染。PCR产物宜密封后丢弃，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。