EASYspin 组织 / 细胞 RNA 快速提取试剂盒 (

保存条件：本试剂盒在室温储存 12 个月不影响使用效果。
产品介绍：
独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞 RNA 酶，然后用乙醇调节结 合条件后,RNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速 的漂洗－离心的步骤，去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐 的 RNase free H2O 将纯净 RNA 从硅基质膜上洗脱。
自备试剂：乙醇, β-巯基乙醇
注意事项：
1.需要自备一次性注射器，研钵。裂解液RLT和去蛋白液RW1中含有刺激性化合物，操 作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清 水或者生理盐水冲洗。
2.关于DNA 的微量残留：
一般说来任何总 RNA 提取试剂在提取过程中无法完全避免 DNA 的微量残留， 本公司的 EASYspin 系列 RNA 提取产品，在大多数 RT-PCR 扩增过程中极其微量的 DNA 残留（一般电泳 EB 染色紫外灯下观察不可见）影响不是很大，如果要进行严 格的 mRNA 表达量分析如荧光定量 PCR，我们建议在进行模板和引物的选择时： 1）选用跨内含子的引物，以穿过 mRNA 中的连接区，这样 DNA 就不能作为模板参与 扩增反应。 2）选择基因组 DNA 和 cDNA 上扩增的产物大小不一样的引物对。

 操作步骤：
提示：
 第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!
 操作前在裂解液 RLT 中加入β-巯基乙醇至终浓度 1%，如 1 ml RLT 中加入 10 μl β- 巯基乙醇。此裂解液最好现用现配。配好的 RLT 4℃可放置一个月。
1.组织培养细胞
a.收集<107悬浮细胞到一个 1.5 ml 离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接裂解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
b.12,000 rpm 离心 10 sec（或者 300×g 离心 5 min），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
c.轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加入 350 μl（<5×106 细胞）或者 600 μl（5×106-1×107细胞）裂解液RLT，吹打混匀后用手剧烈振荡 20 sec，充分裂解。
d.用带钝针头的一次性 1 ml(配 0.9 mm 针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满意匀浆结果（或者电动匀浆 30 sec），可以剪切 DNA，降低粘稠度和提高产量。
e.接操作步骤项下 3。
2.动物组织（例如鼠肝脑）
a.电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块，加入 350 μl(<20 mg 组织)或者600 μl(20-30 mg 组织)的裂解液 RLT 后电动彻底匀浆 20-40 sec。
b.液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20 mg/30 mg)转入装有 350 μl/600 μl 组织裂解液 RLT 的 1.5 ml 离心管中，用手剧烈振荡 20 sec，充分裂解。用带钝针头的一次性 1 ml(配 0.9 mm 针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果（或者电动匀浆 30 sec），可以剪切 DNA，降低粘稠度和提高产量。
c.将匀浆后裂解物 12,000 rpm 离心 3 min，沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物，将裂解物上清小心转到一个新离心管。
d.接操作步骤项下 3。
3.较精确估计裂解物（上清）体积，加入等体积的 70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!），此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心。
4.立刻将混合物（每次小于 700 μl，多可以分两次加入）加入一个吸附柱 RA 中（吸附柱放入收集管中），12,000 rpm 离心 60 sec，弃掉废液。
5.加 350 μl 去蛋白液 RW1，室温放置 30 sec，12,000 rpm 离心 30 sec，弃掉废液。将吸附柱 RA 放回收集管中。
6.DNase I 工作液的配制：取 10 μl DNase I 储存液放入新的 RNase-free 离心管中，加入70 μl RDD 溶液，轻柔混匀。
7.向吸附柱 RA 中央加入 80 μl DNase I 工作液，室温放置 15 min（一般情况下室温放置可得到较好的消化效果，如果室温效果不佳可选择在 37℃放置 15 min）。
8.加 350 μl 去蛋白液 RW1，室温放置 30 sec，12,000 rpm 离心 30 sec，弃掉废液。将吸附柱 RA 放回收集管中。
9.加入 500 μl 漂洗液 RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心 30 sec，弃掉废液。加入 500 μl 漂洗液 RW，重复一遍。
10.将吸附柱 RA 放回空收集管中，12,000 rpm 离心 2 min，将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
11.取出吸附柱 RA，放入一个 RNase free 离心管中，根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位加 30-50 μl RNase free H2O（事先在 65℃水浴中加热效果更好）， 室温放置 1 min，12,000 rpm 离心 1 min。