BspQI 限制性内切酶（10U/μL）

如何做好 Southern 杂交？

所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性 (RFLP) 的检测等。一、基因组 DNA 的制备（前述）二、基因组 DNA 的限制酶切根据实验目的决定酶切 DNA 的量。一般 Southern 杂交每一个电泳通道需要 10-30 μg 的 DNA。购买的限制性内切酶都附有相对应的 10 倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。为保证消化完全，一般用 2-4 U 的酶消化 1 μg 的 DNA。消化的 DNA 浓度不宜太高，以 0.5 μg/μl 为好。由于内切酶是保存在 50% 甘油

反向PCR （inverse-PCR）实验步骤

做PCR，就可扩增到两端为T-DNA插入序列，中间为侧翼序列的片段。2、限制性内切酶消化：选择合适的限制性内切酶，基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前，应对基因组DNA定量。根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI，BamHI和HindIII/PstI，并在酶切位点上游附近设计引物Z1，Z2，Z3和Z4，然后用这些内切酶分别消化基因组DNA，酶切体系如下：Buffer for EcoR I 2μlGenomic DNA 3μlEcoR I 0.5μl （10u/μl）ddH

PCR－RFLP分析技术

外周血DNA为模板，PCR扩增凝血因子FⅧ基因的583bp特异片段产物，其中包含MspⅠRFLP多态位点，经MspⅠ酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测等位片段的长度（583 bp或360 bp+223 bp），以此为遗传标记进行连锁分析，判断胎儿是否得到了带有缺陷FⅧ基因的染色体，从而做出间接基因诊断。 二、材料及试剂 1. DNA（50ng/μl）、引物Ⅰ和Ⅱ（20 μΜ）、TaqDNA聚合酶（5 U/μl）10×PCR反应缓冲液、 dNTP（2.5 mM）、灭菌蒸馏水、液体石蜡、限制性内切酶MspⅠ